在他者协助下：内石微生物群落调节热应激下贻贝的存活、行为与分子响应

《Molecular Ecology》：With a Little Help From Their Friends: Endolithic Microbial Communities Modulate Mussel Survival, Behaviour and Molecular Responses Under Thermal Stress

　　

摘要

随着全球气候变化下热应激的加剧，全球生态系统正经历深刻的转变，扰乱了生物过程、物种分布和生物多样性，其中沿海海洋系统尤为脆弱。生物已进化出行为、生理和形态策略来应对极端条件，而物种间的相互作用，尤其是共生关系，可进一步塑造对应激的响应。这些共生关系常根据环境背景在互利共生到寄生之间沿连续谱发生转变。一个显著的例子是双壳类动物与其内石微生物群落之间的动态关系。在此，研究人员探究了可见的内石壳体腐蚀的变化与贻贝在反复空中热应激期间存活率、行为和分子响应差异之间的关系。具有内石壳体腐蚀的贻贝始终表现出增强的存活率。在行为方面，热应激损害了移动能力（即净移动距离和总移动距离）和足丝产生量（即足丝数量），但具有内石生物的贻贝对这些效应表现出相对缓冲的响应。在分子水平上，具有内石生物的贻贝在热应激后表现出较低的HSP24和HSP70诱导水平，但具有较高的基线HSP60和HSP90表达水平，提示了不同的应激响应通路。综上所述，研究人员的发现揭示了与内石壳体状况相关的宿主响应在行为、分子特征和存活率方面存在一致的多水平差异，表明内石生物可能有助于增强热恢复力，并因此可能在塑造未来气候驱动的热应激下贻贝种群的恢复力方面发挥作用。更广泛而言，这些结果突显了种间相互作用（包括宿主相关微生物群落）在塑造宿主适应性响应中的关键作用。

**研究背景与科学问题**

在全球气候变化背景下，热应激事件日趋频繁和剧烈，潮间带海洋生态系统面临前所未有的温度挑战。潮间带作为热变异性最高、应激最强烈的生境之一，栖息于此的生物已进化出多种行为、生理和形态适应策略以应对极端环境。然而，物种间的相互作用——尤其是共生关系——在调节宿主对环境应激的响应中所扮演的角色仍未被充分认识。在众多共生体系中，双壳类与其内石微生物群落的关系尤为引人注目。内石微生物侵蚀贻贝壳体，传统上被认为对宿主有害，因其降低存活率并迫使贻贝在壳体修复、繁殖、生长和附着强度之间进行能量权衡。然而，近年研究发现，在热应激条件下，壳体侵蚀产生的壳面白化效应可提高反射率、降低热量吸收和体内温度，从而在热浪期间提高存活率。尽管壳体白化的物理保护作用已被证实，但内石微生物是否在分子和行为层面也调节宿主的热应激响应，此前尚不清楚。本研究旨在系统探究内石微生物群落对贻贝在反复热应激下存活率、行为和分子响应的多层面影响，并检验以下假设：（i）具有内石生物的贻贝在热应激下表现出更强的行为耐受性；（ii）其存活率更高；（iii）无内石生物的贻贝基线热休克蛋白（heat shock protein，HSP）表达较低但热暴露后诱导强烈；（iv）有内石生物的贻贝因微生物群落存在而呈现升高的基线HSP表达，且热暴露后进一步增加有限。

**主要技术方法**

研究人员在法国维姆勒（Wimereux）的Pointe aux Oies（50°47′12.3″N 1°36′15.7″E）采集天然具有不同程度内石壳体腐蚀的紫贻贝（*Mytilus edulis*），选取A阶段（无腐蚀）和D阶段（重度腐蚀）个体，标准化壳长2.5–3 cm。实验模拟自然潮汐周期（7小时浸没/5小时露空用于分子实验；6小时浸没/6小时露空用于行为实验），设三种热应激处理：晴天热应激（33°C+光照，光合光子通量密度（PPFD）893–908 μmol photons m^?2 s^?1）、阴天热应激（33°C无光照）和对照（17°C无光照），循环三次，另加第四次露空用于存活实验。分子实验采用定量实时PCR（qPCR）检测外套膜组织中HSP24、HSP60、HSP70和HSP90的表达水平，以rpl14和rps4为内参基因，仅保留雄性个体以消除性别差异。行为实验通过GoPro相机定时拍摄，使用TrackMate插件分析移动距离（总距离和净距离），统计足丝数量和聚集百分比。数据分析采用对齐秩变换（ART）非参数因子分析、广义线性混合效应模型（glmmTMB）和广义线性模型（GLM）。

**研究结果**

**3.1 分子实验结果**

**3.1.1 HSP24**：基线水平上各处理和条件间无显著差异。首次热暴露后，所有热应激处理组的HSP24表达均显著高于对照组和基线水平。第三次热暴露后，HSP24在所有热应激处理中持续保持高水平。值得注意的是，在热光照处理下，无内石贻贝的HSP24表达较首次暴露进一步升高（p=0.03），且显著高于有内石贻贝（p=0.038），表明无内石贻贝需要更强的热诱导响应。

**3.1.2 HSP60**：在所有处理和时点中，有内石贻贝的HSP60表达始终显著高于无内石贻贝（整体p=0.0001）。基线（p=0.005）、首次露空（p=0.01）和第三次露空（p=0.004）各时点均保持此模式。热暗处理下有内石贻贝的HSP60表达显著高于无内石个体（p=0.04）。热光照处理下有内石贻贝在第三次露空后的HSP60较基线显著升高（p=0.04）。

**3.1.3 HSP70**：基线和首次露空后各处理间无显著差异。第三次露空后，无内石贻贝在热光照处理下的HSP70表达显著高于相应对照（p=0.003）和同处理下有内石贻贝（p=0.02），且显著高于自身基线水平（p=0.008）。整体而言，第三次露空后无内石贻贝的HSP70表达显著高于有内石贻贝（p=0.003）。

**3.1.4 HSP90**：所有处理和时点中有内石贻贝的HSP90表达始终显著高于无内石个体（整体p=0.0008）。基线（p=0.01）和首次露空后（p=0.01）差异显著，但第三次露空后差异不再显著。第三次露空后，两种热应激处理均诱导HSP90升高，热光照处理下有内石（p=0.0003）和无内石（p=0.003）贻贝均显著高于各自对照。

**3.2 行为实验结果**

**3.2.1 总移动距离**：基线水平无显著差异。首次露空后，热光照处理下无内石贻贝的移动较基线显著减少（p=0.013），而有内石贻贝未出现此下降。第三次露空后，热光照处理下两种条件的移动均显著低于各自基线（有内石p=0.0001；无内石p=0.008）和相应对照（有内石p=0.005；无内石p=0.008）。

**3.2.2 净移动距离**：首次露空后，热光照处理下两种条件的净移动均显著低于基线和对照（有内石与无内石均p=0.0001）。第二次（夜间）露空后仍保持较低水平（有内石p=0.02；无内石p=0.002）。第三次露空后进一步下降，且无内石贻贝较第二次露空进一步减少（p=0.02）。

**3.2.3 附着强度**：首次露空后，热光照处理下无内石贻贝的足丝数量显著低于对照（p=0.003），而有内石贻贝与对照无显著差异。第三次露空后，热光照处理下两种条件的足丝数量均显著低于各自对照和热暗处理（均p=0.0001）。对照组随时间推移附着强度显著增加，可能反映对反复操作的响应。

**3.2.4 聚集行为**：首次露空后，热光照处理下两种条件的聚集率均较基线显著下降（有内石p=0.004；无内石p=0.004）。第三次露空后，热光照处理下聚集率进一步下降，有内石贻贝在热光照下的聚集率显著低于热暗处理（p=0.004）。

**3.3 存活实验结果**

在热光照处理下，无内石贻贝的死亡率显著高于有内石贻贝（p=0.0001）。四次连续的30°C热暴露导致无内石贻贝约80%的死亡率，而有内石贻贝仅约25%。无内石贻贝在热光照下的死亡率也显著高于热暗和对照处理（均p=0.0001）。有内石贻贝在热光照下的死亡率同样显著高于对照（p=0.009）和热暗处理（p=0.009）。

**讨论与结论**

本研究表明，内石微生物对贻贝热应激响应的保护效应远超物理层面的壳体白化，而是深入到分子和行为层面的整合性缓冲机制。在分子水平上，有内石贻贝表现出HSP60和HSP90的组成性高表达，这代表一种转录前置（transcriptional frontloading）机制——通过维持保护性基因的高基线表达，降低后续热应激时对强烈诱导响应的需求。这种模式解释了为何有内石贻贝在热应激下HSP24和HSP70的诱导幅度较无内石个体更低。热暗处理的设计有效区分了分子缓冲和壳体白化的贡献：无内石贻贝在无光照条件下表现出与有内石个体相当的HSP24和HSP70水平，证实壳体白化通过减少太阳辐射吸收在降低热负荷中发挥关键作用。值得注意的是，HSP70未因内石存在而诱导，提示内石微生物并未触发经典的HSP70介导的免疫应答，尽管HSP60和HSP90的持续上调表明宿主-共生体间确实存在相互作用。

在行为层面，热应激显著损害移动能力、足丝产生和聚集行为，但有内石贻贝表现出明显的缓冲效应。有内石贻贝在首次热暴露后仍能维持正常移动，而无内石个体已出现显著下降；足丝产生方面，有内石贻贝在热光照下与对照无显著差异，而无内石个体显著减少。基线非应激条件下未检测到两组间行为差异，表明内石共生在正常条件下不产生行为代价，仅在热应激时显现益处。

存活实验提供了最直接的适应性证据：四次热暴露后无内石贻贝死亡率约80%，有内石仅约25%。这一显著差异结合分子和行为层面的发现，证明内石微生物通过“双重保护策略”——组成性分子缓冲和壳体白化的热缓解效应——协同增强贻贝的热耐受性。鉴于贻贝作为关键生态系统工程师的地位，其种群的持续存在支撑着整个潮间带群落的恢复力。内石微生物增强贻贝热耐受性的能力可能通过维持贻贝床的稳定性和微生境供给，对生物多样性和生态系统功能产生级联效应。更重要的是，内石侵蚀现象广泛存在于钙化生物中，提示类似的宿主-共生体相互作用可能在更广泛的生态系统中扮演着尚未被充分认识的角色。本研究的发现强调，在预测气候变化下物种和种群的命运时，必须将共生相互作用纳入考量框架，而非仅关注单一物种的生理耐受极限。