发育性和MAPK响应性转录因子调控胰腺癌中不同的恶性细胞状态及相关遗传依赖性

《Nature Genetics》：Developmental and MAPK-responsive transcription factors regulate distinct malignant cell states and associated genetic dependencies in pancreatic cancer

　　

广泛共识认为，人胰腺导管腺癌（PDA）的恶性上皮细胞包含多种分子上不同的状态。然而，对这些状态如何调控——包括其机制决定因素、依赖性、可塑性和功能特性——的精确表征仍然难以捉摸。研究人员对多个PDA队列进行单细胞主调控因子（MR）分析，识别出三种共存且分子上不同的发育谱系状态中的恶性细胞，这些状态具有不同的组织病理学形态和空间结构。这些状态包括由上皮-间充质转化（EMT）相关MR驱动的低分化谱系，以及分别由胃肠道上皮发育和胰腺发育MR驱动的两种高分化状态。此外，每种状态包含两个表观遗传学上不同的亚状态，分别具有低MAPK信号活性和高MAPK信号活性。基于条形码的谱系追踪证实了自发性和治疗依赖性的跨状态可塑性。此外，功能缺失研究证实了状态特异性MR的必需性，而它们的异位表达在体外和体内均有效地重编程了细胞状态，从而为PDA异质性提供了基于机制的基础，并为药理学靶向提供了路线图。

胰腺导管腺癌（PDA）是癌症相关死亡的第三大原因，对细胞毒性、靶向和免疫疗法高度耐药。尽管PDA存在相对一致的DNA变异谱（包括KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4的频繁突变），但肿瘤异质性，尤其是不同转录-表观遗传状态的恶性亚群共存及其可塑性，被认为是化疗耐药的主要因素。先前基于bulk组织的研究确定了至少两种转录亚型（分化良好的经典/祖细胞型与低分化的基底样/鳞状型），但它们在单细胞水平的机制驱动因素、非癌基因依赖性和可塑性仍不明确。单细胞RNA测序（scRNA-seq）面临基因缺失（>80%基因不可检测）和bulk分类器平均信号的问题，阻碍了新型细胞状态的发现。为此，研究人员采用基因调控网络（GRN）分析，基于超过1800个调控蛋白（包括转录因子（TF）和共因子（co-TF））的活性，来表征恶性PDA细胞状态，该方法已优于基因表达分析，并成功揭示了肿瘤启动、进展、异质性和药物敏感性的机制。

研究人员利用metaVIPER（单细胞扩展的VIPER算法）对来自6个公共scRNA-seq数据集的110个PDA样本中的恶性细胞进行GRN分析，识别出6种共存的、分子上不同的细胞状态，这些状态在几乎所有样本中保守。这些状态包括3个胰腺发育谱系（PDL）：胃肠道谱系状态（GLS）、原始谱系状态（PLS）和形态发生状态（MOS），分别由胃肠道上皮发育、胰腺发育和上皮-间充质转化相关的主调控因子（MR）驱动；每个PDL进一步根据MAPK通路活性分为M+（MAPK高）和M-（MAPK低）亚状态。通过空间转录组学（10x Xenium技术，使用定制100基因面板分析8个初治PDA样本）、多组学分析（单细胞ATAC-seq，scATAC-seq）、CRISPR-Cas9介导的敲除（CRISPR KO）和CRISPR-dCas9介导的抑制（CRISPRi）筛选、条形码谱系追踪以及异位表达实验，研究人员验证了这些状态的调控机制、可塑性和依赖性的功能相关性。主要关键技术方法包括：基于metaVIPER的GRN分析整合四个高质量PDA队列（国际癌症基因组联盟ICGC、癌症基因组图谱TCGA、北卡罗来纳大学和哥伦比亚大学CUMC-E，后者包含来自200例PDA患者的激光捕获显微切割LCM样本）的ARACNe网络；空间转录组学分析8个初治PDA样本；多组学分析MOS富集的KP4细胞系；在6个细胞系（GLS富集的PATU8988S、HPAFII、CAPAN1；MOS富集的PANC1、KP4、PK45H）中进行CRISPR KO和CRISPRi筛选，并在7只免疫缺陷小鼠中进行体内验证；条形码谱系追踪在Hs766T、KP4、PATU8988S细胞系中分析可塑性；异位表达在KP4细胞中过表达GLS MRs进行重编程实验。

**研究结果**

**PDA的转录状态**：通过metaVIPER对Elyada数据集的恶性细胞进行GRN分析，结合Louvain聚类和Monocle伪时间轨迹，识别出六个细胞状态，代表三个PDL（GLS、MOS、PLS）及其各自的两个MAPK相关亚状态（M+和M-）。GLS由胃肠道TF（如HNF4A、HNF1A、GATA4、GATA6）激活；MOS由EMT TF（如NOTCH1、ZEB2、SNAI1、SNAI2）激活；PLS由胰腺祖细胞TF（如ONECUT1、NKX6.1、PDX1）激活。M+和M-亚状态的MR在三个PDL中保守，其活性与RAS/MAPK信号相关，并通过实验性RAF/MEK/ERK抑制剂处理在PDA细胞系中验证。

**PDA细胞状态的稳健性和组织病理学特征**：在来自5个独立数据集的恶性细胞中，约87%的细胞仅富集于六个状态之一（P≤0.05，aREA），表明高重现性。MOS细胞在部分数据集中比例较低，与上皮标记选择策略一致。在7个PDA细胞系和患者来源异种移植模型（PDX）中，至少两个PDL谱系共存，且M+细胞在培养中占主导，而M-细胞在原发性肿瘤中占主导，与p-ERK染色阴性结果一致。

**人PDA的结构**：通过10x Xenium空间转录组学分析8个初治PDA样本，发现GLS细胞局限于腺体结构，呈分化良好形态；MOS细胞呈低分化，沿腺体基底外侧或侵入间质；PLS细胞见于腺体结构和侵入间质。不同肿瘤间及同一肿瘤内高度异质性。MAPK状态与组织病理学特征无关，大多数恶性细胞为M-状态。

**GLS和MOS细胞状态驱动bulk组织聚类**：对TCGA和ICGC的bulk RNA-seq数据进行metaVIPER分析，得到两个聚类（bulk-GLS和bulk-MOS），其MRs高度富集于单细胞GLS和MOS MRs（P≤2.8×10^-5和P≤2.4×10^-6，aREA）。MOS状态与更差预后和低分化相关（P=5.2×10^-4，风险比=1.8；P=1.0×10^-3，χ²检验）。DNA甲基化数据显示GLS与MOS样本间表观遗传模式差异。

**条形码谱系追踪揭示突变非依赖性可塑性**：在Hs766T细胞中，来自GLS、MOS和PLS的条形码在T1时间点均出现在所有三个谱系中，证实广泛的自发性谱系可塑性。在KP4和PATU8988S细胞中，M+和M-亚状态之间也存在广泛转换。用MEK抑制剂曲美替尼处理KP4细胞后，M+向M-的转换显著增加（P=9.2×10^-152，自举法），表明药物诱导的可塑性。

**MAPK亚状态是表观遗传上不同的**：对KP4细胞的多组学分析显示，M+和M-亚状态独立于细胞周期阶段（G1和G2/M期均存在两个亚簇）。差异染色质可及性分析鉴定出2027个差异可及峰（DAP），其富集的TF基序（如MYC、HIF1A、ETS1、ELK1/3）在M+与M- MRs中显著富集，表明M+和M-是表观遗传上不同的细胞状态。

**PDA必需性是细胞状态特异性的**：在6个细胞系中进行CRISPR KO和CRISPRi筛选，发现GLS和MOS MRs在其匹配的细胞状态中显著富集于必需性基因（P=9.1×10^-5，GSEA）。关键的GLS必需MR包括CDX2、GATA6、HNF1A；MOS必需MR包括MYBL1、ZEB1、GLI2。体内CRISPR筛选（在7只免疫缺陷小鼠中）进一步确认了HNF1A（GLS）和BPTF（MOS）等MR的状态特异性必需性（P=6.7×10^-4，GSEA）。

**异位MR表达重编程PDA细胞状态**：在MOS富集的KP4细胞中异位表达8个GLS MRs，发现OVOL2单独表达即可有效诱导MOS向GLS的重编程（P=4.3×10^-15，aREA），并抑制ZEB1和波形蛋白（VIM），上调E-钙黏蛋白（E-CAD）。单细胞分析显示，OVOL2与HNF1A组合的重编程效率最高（45%细胞被分类为GLS）。体内实验证实OVOL2和HNF1A单独或联合表达均能诱导KP4异种移植瘤向GLS样状态重编程（P_OVOL2=1.4×10^-6，P_HNF1A=5.3×10^-5，联合P=1.9×10^-9，GSEA）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，从bulk PDA表达数据解析分子状态因肿瘤异质性和队列变异性而困难，但分化良好与低分化肿瘤的区分已指导临床实践。单细胞分析可改善肿瘤内异质性评估，但面临基因缺失和因果驱动因素缺乏洞察的挑战。本研究通过GRN分析解决了这些问题，鉴定出维持六种分子上不同肿瘤状态的蛋白，并通过CRISPR筛选确认了状态特异性非癌基因依赖性。尽管已鉴定出GLS和MOS的有效蛋白标记，但PLS标记的缺乏是研究局限性。本工作鉴定的MRs构成了维持细胞状态同一性和存活性的可检验预测，其异位表达验证了PDA可塑性决定因素。功能筛选确认GLS和MOS MRs对细胞状态存活性的贡献，提供了靶向PDA异质性的治疗路线图。在每个谱系内，M+和M-亚状态由RAS/MAPK活性区分，尽管存在普遍激活的KRAS突变，但大多数体内恶性细胞p-ERK低表达，表明突变KRAS依赖于上游受体酪氨酸激酶信号，且M-状态在体内占主导，而M+在体外占主导，这对药物筛选有重要意义。研究结论：肿瘤状态被“量子化”为少数稳定状态，而非连续体。这种“量子癌症生物学”范式提示，靶向所有六种PDA状态的联合疗法可有效应对几乎所有患者的可塑性，避免昂贵个性化治疗。两种替代策略可能可行：结合靶向互补状态的药物；或将治疗不敏感状态重编程为敏感状态，例如利用新型突变KRAS抑制剂。两种方法均可采用序贯而非同时给药，以限制药物组合的潜在毒性。