一种具有E蛋白融合环突变的寨卡病毒疫苗通过CD8+ T细胞提供保护

《Nature Microbiology》：A Zika virus vaccine with E protein fusion loop mutations protects via CD8+ T cells

　　

目前尚无有效的寨卡病毒（ZIKV）疫苗。候选疫苗以ZIKV包膜（E）蛋白为主要靶点，该蛋白是抗ZIKV中和抗体（nAbs）的主要靶标。研究人员利用DNA和RNA平台，比较了表达野生型（WT）前膜蛋白（prM）和E蛋白（Z-prM/E-WT）或带有融合环（FL）突变（Z-prM/E-FLM）的病毒样颗粒疫苗，这些突变可限制感染中的抗体依赖性增强。两种疫苗在C57BL/6 Ifnar1^?/?小鼠中均诱导了有效的抗感染保护，但机制不同。Z-prM/E-WT疫苗诱导了针对未成熟和成熟ZIKV病毒颗粒的nAbs，而Z-prM/E-FLM疫苗中的突变损害了prM切割，导致抗体反应欠佳，无法中和成熟病毒颗粒。在两个小鼠模型中进行的血清转移和T细胞耗竭实验表明，CD8⁺ T细胞对于Z-prM/E-FLM诱导的短期保护是必要且充分的，而抗体和CD8⁺ T细胞均参与了Z-prM/E-WT诱导的长期保护。研究结果揭示了CD8⁺ T细胞在主要由nAb导向的prM/E基ZIKV疫苗介导的保护中发挥了意想不到的作用。研究还表明，仅依赖CD8⁺ T细胞的抗体中心型ZIKV疫苗提供的保护是短暂的，而能同时诱导保护性抗体和CD8⁺ T细胞的疫苗提供的保护是持久的。

**研究背景与问题**
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）属于黄病毒属（Orthoflavivirus），与登革病毒（dengue virus, DENV）同属，主要通过伊蚊叮咬传播，也可经性传播和垂直传播。ZIKV感染可导致胎儿畸形（如小头畸形和视觉异常），并可能引起长期神经系统问题。目前尚无获批的ZIKV疫苗，许多候选疫苗靶向E蛋白以诱导中和抗体（neutralizing antibodies, nAbs）。然而，针对一种黄病毒产生的交叉反应抗体可能通过抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement, ADE）加重异源黄病毒感染，这是ZIKV疫苗开发的关键挑战。E蛋白EDII结构域中的融合环（fusion loop, FL）区域是免疫优势表位，但主要诱导弱中和性、促进ADE的交叉反应抗体。因此，研究人员设计了携带FL突变（T76R、Q77E、W101R和L107R）的prM/E基疫苗（Z-prM/E-FLM），以降低ADE风险，但其免疫保护机制尚不明确。本研究旨在比较Z-prM/E-WT和Z-prM/E-FLM疫苗在抗体及T细胞应答方面的免疫原性，并阐明FLM疫苗的保护机制。

**研究方法与关键结论**
研究人员利用DNA和RNA（复制子RNA-脂质纳米颗粒，LNP）平台，在C57BL/6野生型（WT）小鼠、C57BL/6 Ifnar1^?/?小鼠（干扰素α/β受体缺陷）和HLA-B*0702 Ifnar1^?/?小鼠中开展免疫和攻毒实验。通过血清转移、CD8⁺ T细胞耗竭和过继转移实验，结合中和抗体检测、流式细胞术、Western blot及AlphaFold2结构预测，系统评估了疫苗诱导的保护机制。论文发表在《Nature Microbiology》，主要结论包括：Z-prM/E-FLM疫苗通过CD8⁺ T细胞（部分依赖IFN-γ）提供短期保护，而Z-prM/E-WT疫苗通过抗体和CD8⁺ T细胞共同提供长期保护；FL突变损害了prM切割，导致诱导的抗体无法有效中和成熟ZIKV病毒颗粒，从而改变了保护机制。

**主要关键技术方法**
本研究采用的关键方法包括：构建pVAX1载体DNA疫苗和基于甲病毒复制子的RNA-LNP疫苗，分别表达Z-prM/E-WT或Z-prM/E-FLM；在C57BL/6 Ifnar1^?/?和HLA-B*0702 Ifnar1^?/?小鼠模型（来源于Jackson Laboratories、华盛顿大学圣路易斯分校和La Jolla免疫研究所）中进行免疫和攻毒；通过血清被动转移、CD8⁺ T细胞耗竭（使用抗CD8单克隆抗体）和过继转移实验验证保护机制；利用DC-SIGN细胞中和实验和Vero-hfurin细胞来源成熟病毒检测中和抗体；流式细胞术分析脾脏T细胞产生IFN-γ、TNF、IL-2及脱颗粒标志物CD107a；Western blot检测prM切割效率；AlphaFold2模拟E蛋白和prM/E异二聚体结构。

**研究结果**
**1. Z-prM/E-WT和Z-prM/E-FLM DNA疫苗的构建与验证**
通过Western blot和免疫荧光显微镜验证，两种疫苗均能在293T细胞中成功表达E蛋白，但Z-prM/E-FLM疫苗表达的E蛋白不被针对FL构象表位的4G2抗体识别，符合预期。

**2. Z-prM/E-WT和Z-prM/E-FLM DNA疫苗具有高免疫原性**
在C57BL/6-WT和Ifnar1^?/?小鼠中，两种疫苗诱导的抗ZIKV E IgG滴度和50%中和活性（NT₅₀）滴度相似，且均显著高于对照组。CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答（包括多功能细胞亚群）也无显著差异，表明两种疫苗在细胞免疫原性上相当。

**3. Z-prM/E-WT和Z-prM/E-FLM DNA疫苗诱导短期保护**
在攻毒后3天，两种疫苗均显著降低血清和组织中的ZIKV感染性颗粒和RNA水平，并保护小鼠免受致死剂量ZIKV攻击（存活率、临床评分和体重减轻）。但Z-prM/E-FLM疫苗诱导的CD8⁺ T细胞应答（特别是IFN-γ⁺和IFN-γ⁺CD107a⁺亚群）显著高于Z-prM/E-WT疫苗组。

**4. Z-prM/E-WT而非Z-prM/E-FLM DNA疫苗提供长期保护**
在末次免疫后12周攻毒，Z-prM/E-WT疫苗组小鼠组织中感染性病毒和RNA水平显著降低，而Z-prM/E-FLM疫苗组与对照组无显著差异，尽管两者抗体和T细胞水平相似，表明FLM疫苗的保护是短暂的。

**5. Z-prM/E-WT和Z-prM/E-FLM DNA疫苗通过不同机制保护**
血清转移实验：Z-prM/E-WT疫苗免疫血清可保护受体小鼠，而Z-prM/E-FLM疫苗血清无效，说明FLM疫苗诱导的抗体缺乏体内保护能力。CD8⁺ T细胞耗竭实验：耗竭CD8⁺ T细胞后，Z-prM/E-FLM疫苗的保护作用显著减弱，而Z-prM/E-WT疫苗的保护不受影响。CD8⁺ T细胞过继转移实验：来自Z-prM/E-FLM疫苗免疫小鼠的CD8⁺ T细胞足以降低受体小鼠的病毒载量，且IFN-γ中和抗体可部分逆转此保护效果。这些结果表明，Z-prM/E-FLM疫苗的保护完全依赖于CD8⁺ T细胞（部分通过IFN-γ），而Z-prM/E-WT疫苗的保护由抗体和CD8⁺ T细胞共同介导。

**6. 基于RNA复制子的Z-prM/E-FLM疫苗诱导CD8⁺ T细胞介导的保护**
在HLA-B*0702 Ifnar1^?/?小鼠中，RNA-LNP形式的Z-prM/E-FLM疫苗同样通过CD8⁺ T细胞提供保护，血清转移无效，CD8⁺ T细胞耗竭消除保护，过继转移降低病毒RNA，证实该机制不依赖疫苗平台和MHC I类分子。

**7. Z-prM/E-FLM疫苗诱导的抗体对成熟ZIKV中和活性降低**
与Z-prM/E-WT疫苗相比，Z-prM/E-FLM疫苗免疫血清对Vero-hfurin细胞来源的成熟ZIKV病毒的中和滴度显著降低，仅36%的小鼠血清检测到中和活性，表明FLM疫苗诱导的抗体无法有效中和成熟病毒颗粒。

**8. ZIKV E蛋白FL区域突变损害prM切割**
Western blot显示，Z-prM/E-FLM疫苗产生的病毒样颗粒中主要含有未切割的prM蛋白，而Z-prM/E-WT疫苗颗粒中同时存在M和prM。AlphaFold2结构预测表明，FL突变（引入正电荷）改变了prM furin切割位点附近的局部电荷环境，从而阻碍了prM切割，进而影响成熟病毒中和抗体的产生。

**讨论与结论**
本研究揭示了CD8⁺ T细胞在prM/E基ZIKV疫苗保护中的关键作用，尤其是在缺乏有效成熟病毒中和抗体的情况下。Z-prM/E-FLM疫苗通过诱导CD8⁺ T细胞（部分依赖IFN-γ）提供短期保护，但此T细胞依赖性保护是短暂的，而Z-prM/E-WT疫苗通过抗体和CD8⁺ T细胞提供持久保护。FL区域不仅含有诱导ADE抗体的免疫优势表位，还通过影响prM切割参与成熟病毒中和抗体的产生。这些结果对黄病毒疫苗设计具有直接意义：旨在降低ADE风险的FL突变可能无意中损害了中和抗体质量及保护持久性，即使短期保护得以保留。未来研究应探索增强CD8⁺ T细胞保护持久性的策略，例如新型佐剂或结合结构抗原与细胞表位。

**研究结论翻译**：总之，本研究提供了机制性证据，表明CD8⁺ T细胞（至少部分通过产生IFN-γ）在缺乏针对成熟ZIKV病毒颗粒有效nAb反应的情况下，对Z-prM/E-FLM疫苗诱导的保护发挥关键作用。然而，这种T细胞依赖性保护是短暂的：尽管Z-prM/E-WT疫苗接种提供持久保护，而Z-prM/E-FLM介导的免疫在12周后便无法维持，尽管抗体和T细胞水平相当，这强调了抗体和T细胞应答之间的相互作用是长期疫苗效力的关键决定因素。未来研究应探索增强保护性CD8⁺ T细胞应答持久性的策略，可能通过选择新型佐剂或结合结构抗体抗原与细胞表位或靶蛋白。研究结果还揭示了E蛋白FL区域先前未被充分认识的双重作用：它含有诱导ADE抗体的免疫优势表位，但在结构上也是高效prM切割以及随后产生能中和成熟病毒颗粒的抗体所必需的。总的来说，这些结果对黄病毒疫苗的设计具有直接意义，表明旨在降低ADE风险的突变可能无意中损害了nAb质量和保护持久性，即使短期保护得以保留。