整合 bulk 与单细胞转录组学分析鉴定少肌症中衰老相关的枢纽基因及微环境重塑

《Functional & Integrative Genomics》：Integrated bulk and single-cell transcriptomic analyses identify senescence-related hub genes and microenvironmental remodeling in sarcopenia

　　

摘要

越来越多的证据表明，细胞衰老、代谢功能障碍、基质重塑和免疫扰动共同促成了疾病的进展。然而，在少肌症中具有诊断潜力且与微环境相关的衰老相关生物标志物仍未得到充分定义。我们整合了来自少肌症和对照样本的整体转录组数据，以及来自 GenAge 和 CellAge 数据库的衰老相关基因集，以鉴定衰老相关的差异表达基因（DEGs）。通过主成分分析（PCA）、火山图可视化、热图聚类、功能富集分析和基因集富集分析（GSEA）对转录组景观进行了表征。使用三种互补的机器学习算法筛选候选诊断基因：最小绝对收缩和选择算子（LASSO）、支持向量机 - 递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（RF）。通过受试者工作特征（ROC）分析、列线图构建和决策曲线分析（DCA）评估诊断性能。通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）和 xCell 反卷积估计免疫和基质浸润模式。进一步进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、伪时间轨迹分析、以枢纽基因为中心的 GSEA/GSVA、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、免疫检查点相关性分析和配体 - 受体通讯分析，以研究枢纽基因的细胞定位、动态表达模式和潜在调控作用。进行了动物实验以验证主要分析的可靠性。在少肌症中共鉴定出 42 个衰老相关 DEGs。功能富集分析表明，激酶活性调节、受体酪氨酸激酶相关信号传导、JAK-STAT 信号传导、AMPK 信号传导、ERK1/2 级联调节和细胞外基质相关通路显著参与其中。GSEA 显示在少肌症中 NABA 核心基质组呈正富集，而柠檬酸循环和呼吸电子传递途径呈负富集。综合机器学习分析将 PCK1、EGFR 和 MAPKAPK3 确定为衰老相关的枢纽基因。PCK1 和 EGFR 在少肌症中显著上调，而 MAPKAPK3 显著下调。诊断的个体 AUC 值分别为 0.777（PCK1）、0.764（EGFR）和 0.751（MAPKAPK3），而联合三基因模型实现了提高后的 0.801 AUC 值。免疫浸润分析显示，PCK1 和 EGFR 与成纤维细胞相关基质特征呈正相关，而 MAPKAPK3 呈相反趋势，与 Th1 细胞相关免疫特征联系更紧密。单细胞和伪时间分析进一步证明，这些枢纽基因在肌源性谱系中表现出不同的细胞定位和动态表达模式。WGCNA 和免疫检查点分析支持它们参与与少肌症相关的更广泛的调控网络。此外，以 EGFR 为中心的虚拟敲除分析揭示了细胞间通讯的显著改变，特别是涉及成纤维细胞和肌肉相关区室。在大鼠少肌症模型中的实验验证证实了生物信息学发现：与对照组相比，少肌症组中 PCK1 和 EGFR 的 mRNA 和蛋白水平显著上调，而 MAPKAPK3 显著下调（所有 P?<?0.05），支持了所鉴定枢纽基因的可靠性。PCK1、EGFR 和 MAPKAPK3 是少肌症中衰老相关的候选生物标志物，可能反映了涉及代谢适应、基质重塑、免疫微环境改变和肌源性失调的截然不同但相互关联的生物过程。其中，EGFR 可能代表与少肌症中骨骼肌微环境通讯相关的重要信号节点。