全反式维甲酸抑制CD8+ T细胞终末耗竭并增强抗PD-1疗法在胶质母细胞瘤中的作用

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：All-trans retinoic acid suppresses CD8+ T-cell terminal exhaustion and potentiates anti-PD-1 therapy in glioblastoma

　　

CD8⁺ T细胞的终末耗竭限制了免疫检查点阻断（ICB）的疗效，尤其是在以免疫抑制性肿瘤微环境为特征的胶质母细胞瘤中。因此，更好地理解终末耗竭的调控因子可能克服对ICB的内在耐药性并提高免疫疗法的疗效。在本研究中，研究人员报道了全反式维甲酸（ATRA）抑制CD8⁺ T细胞终末耗竭。在体外CD8⁺ T细胞活化过程中给予ATRA可赋予其对终末耗竭的抵抗性，并保留效应细胞因子的产生和效应功能。机制上，ATRA通过激活经典WNT/β-catenin通路选择性诱导T细胞因子1的长亚型（TCF-1^βBD）的表达。在小鼠胶质瘤模型中，过继转移的ATRA预处理CD8⁺ T细胞表现出TCF-1^βBD和β-catenin表达增加以及对耗竭的抵抗性，从而导致肿瘤浸润CD8⁺ T细胞的多功能性增强和胶质瘤抑制增强。重要的是，口服ATRA也抑制了肿瘤浸润CD8⁺ T细胞的终末耗竭，并与抗PD-1疗法协同作用，克服了两种胶质瘤小鼠模型中对免疫检查点阻断（ICB）的耐药性。ATRA和抗PD-1联合治疗还通过显著减少手术切除后胶质瘤小鼠模型的复发显示出协同治疗潜力。对接受抗PD-1治疗的胶质母细胞瘤患者进行单细胞转录组分析显示，响应者的CD8⁺ T细胞富集了响应维甲酸和WNT相关基因的基因，这与改善的生存率相关。这些发现确立了ATRA通过诱导WNT/β-catenin依赖性TCF-1^βBD表达来调节CD8⁺ T细胞耗竭，表明ATRA在克服胶质瘤对ICB耐药性方面具有治疗潜力。

**论文解读：全反式维甲酸通过WNT/β-catenin-TCF-1^βBD轴抑制CD8⁺ T细胞终末耗竭并增强抗PD-1疗法在胶质母细胞瘤中的疗效**

**研究背景与目的**

T细胞耗竭是慢性抗原刺激和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）导致的渐进性分化过程，其特征是效应功能逐步丧失，最终进入终末耗竭状态。免疫检查点阻断（ICB）疗法虽能恢复部分T细胞功能，但终末耗竭的T细胞对ICB响应极差，这在具有强促耗竭TME的胶质母细胞瘤（GBM）中尤为突出。T细胞因子1（TCF-1）是维持T细胞功能的关键转录因子，其长亚型（TCF-1^βBD）通过与β-catenin相互作用激活基因表达，而短亚型（TCF-1^ΔβBD）则抑制转录。在慢性刺激下，TCF-1表达下调，促进耗竭。因此，理解调控TCF-1亚型表达的机制，有望克服ICB耐药。全反式维甲酸（ATRA）是维生素A的活性形式，在CD4⁺ T细胞分化中发挥重要作用，但其在CD8⁺ T细胞耗竭中的作用尚不清楚。本研究旨在探索ATRA是否通过调节TCF-1亚型表达来抑制CD8⁺ T细胞终末耗竭，并增强抗PD-1疗效。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

**研究方法概述**

研究人员采用OT-I TCR转基因小鼠来源的CD8⁺ T细胞，与OVA表达的小鼠胶质瘤细胞GL261-OVA在缺氧（1% O₂）条件下共培养，建立体外耗竭模型。通过流式细胞术检测耗竭标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3、CD39）和效应分子（CD69、IL-2、IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B、CD107A）。利用定量PCR和流式细胞术评估TCF-1亚型及WNT通路分子表达。通过shRNA敲低β-catenin或使用WNT激动剂SKL2001验证机制。体内实验采用原位GL261胶质瘤模型和EGFRvIII过表达/Trp53/Pten缺失的自发胶质瘤模型，口服ATRA（200 μg/头）联合腹腔注射抗PD-1抗体（200 μg/头）。手术切除后复发模型通过肿瘤切除后监测生存。人类样本来源于公开数据集（GSE235913单细胞RNA测序和CGGA mRNAseq_693队列），使用CIBERSORTx进行去卷积分析。

**研究结果**

**ATRA抑制CD8⁺ T细胞终末耗竭并保留效应功能**
体外耗竭模型中，ATRA预处理（ATRA OT-I）的CD8⁺ T细胞较对照组（CTRL OT-I）共表达四种耗竭标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3、CD39）的细胞比例显著降低，表明终末耗竭减少。ATRA OT-I细胞在PMA/离子霉素刺激后，CD69表达、IL-2、IFN-γ、TNF-α产生及多功能T细胞比例均显著升高，颗粒酶B⁺CD107A⁺细胞比例增加，肿瘤细胞杀伤能力增强。RNA测序显示ATRA处理上调了细胞因子信号和T细胞活化相关通路。

**经典WNT/β-catenin信号介导ATRA驱动的TCF-1^βBD表达及耗竭抵抗**
ATRA处理增加了Tcf7总转录本和Tcf7^βBD转录本表达，且体外耗竭后TCF-1^βBD蛋白水平升高。ATRA上调了WNT受体Fzd1和配体Wnt3a的转录，以及β-catenin蛋白表达。使用shRNA敲低β-catenin后，ATRA诱导的TCF-1^βBD上调被消除，耗竭标志物共表达增加，效应功能（CD69、细胞因子、细胞毒性）恢复作用消失。WNT激动剂SKL2001模拟了ATRA的效果，上调β-catenin和TCF-1^βBD，减少终末耗竭。

**ATRA在体内增强CD8⁺ T细胞功能，防止胶质瘤微环境中的终末耗竭**
将ATRA预处理的OT-I T细胞过继转移至原位GL261胶质瘤小鼠后，肿瘤浸润的ATRA OT-I T细胞数量增加，β-catenin和TCF-1^βBD表达升高，终末耗竭标志物共表达减少，而效应功能（CD69、IL-2、IFN-γ、TNF-α、多功能性、颗粒酶B/CD107A）增强，肿瘤体积显著缩小。

**口服ATRA治疗抑制CD8⁺ T细胞耗竭并增强体内胶质瘤抑制**
口服ATRA两周后接种GL261-OVA细胞，显著延长生存期并减少肿瘤负荷。ATRA增加了肿瘤浸润CD8⁺ T细胞总数及OVA特异性CD8⁺ T细胞数量，且CD8⁺ T细胞敲除实验证实了ATRA的疗效依赖于CD8⁺ T细胞。ATRA处理组肿瘤浸润OVA特异性CD8⁺ T细胞中β-catenin和TCF-1^βBD表达上调，终末耗竭比例降低，效应功能增强，且离体共培养中肿瘤细胞杀伤能力提高。

**ATRA通过减轻CD8⁺ T细胞耗竭增强抗PD-1疗效**
在自发胶质瘤模型（抗PD-1耐药）中，单用ATRA或抗PD-1均无效，但联合治疗显著延长生存期并减少肿瘤负荷。联合组CD8⁺ T细胞中TCF-1^βBD和β-catenin表达升高，终末耗竭减少，效应功能（CD69、IL-2、IFN-γ、TNF-α、多功能性、颗粒酶B/CD107A）显著增强，且肿瘤细胞杀伤能力提高。在GL261模型中同样观察到协同效应。

**ATRA给药增强抗PD-1疗法对复发胶质瘤的疗效**
在手术切除后复发模型中，联合ATRA和抗PD-1治疗显著延长生存期并实现长期生存（部分小鼠无复发），而单药治疗仅短期改善。联合组肿瘤浸润CD8⁺ T细胞中TCF-1^βBD和β-catenin表达升高，终末耗竭减少，效应功能增强。人类单细胞转录组分析显示，抗PD-1响应者中CD8⁺ T细胞的RA-DEG（ATRA差异表达基因）和WNT信号特征评分显著高于非响应者，且两者呈正相关，同时响应者的耗竭评分较低。在CGGA队列中，RA响应性CD8⁺ T细胞（CD8^TRA）丰度高的患者总体生存期显著更长。

**讨论与结论**

本研究发现ATRA通过激活经典WNT/β-catenin通路，选择性诱导TCF-1^βBD表达，从而抑制CD8⁺ T细胞终末耗竭并保留效应功能。该机制在体外和体内胶质瘤微环境中均得到验证，且口服ATRA与抗PD-1疗法协同作用，克服了ICB耐药，并在手术切除后复发模型中防止复发。人类数据进一步支持ATRA响应性CD8⁺ T细胞特征与抗PD-1疗效及生存预后的关联。研究结论：ATRA通过WNT/β-catenin依赖的TCF-1^βBD诱导抑制CD8⁺ T细胞终末耗竭，增强抗胶质瘤免疫反应，为改善胶质瘤免疫治疗策略提供了新方向。