: 一种用于杏高分辨率S-locus基因分型的新一代测序方法

《Scientific Reports》：A next-generation sequencing approach for high-resolution S-locus genotyping in apricot

　　

大多数温带果树作物表现出配子体自交不亲和性(GSI)机制，该机制阻止不亲和的花粉管生长并促进远交。在李属物种中，该系统由多等位基因的S-locus控制，该基因座包含S单倍型特异性F-box(SFB)和S-RNase基因。准确确定S单倍型对果树育种和果园设计具有重要意义，传统上依赖于基于聚合酶链反应(PCR)的分析。然而，基于PCR的方法结合许多S等位基因的部分测序，可能导致模糊或不正确的等位基因鉴定。新一代测序(NGS)技术已经产生了大量杏基因组数据集，并揭示了额外的自交不亲和等位基因，但许多种质的S-locus基因型仍然未知。在此，研究人员提出了一种基于NGS的高分辨率S-locus基因分型方法，该方法基于基因组过滤、映射到合成参考序列以及自动化S等位基因调用。该方法并非旨在取代常规的基于PCR的S基因分型，而是在需要序列级别验证、澄清模糊基因型或鉴定以前未表征的等位基因的情况下作为其补充。使用该方法，在226个杏品种中推断出了S单倍型，包括187个新的基因型分配，30个先前报告基因型的确认，以及9个与先前报告不同的案例。这些结果将授粉需求可用信息扩展到422个杏品种。基于序列的已报告等位基因比较记录了22个潜在的同物异名案例和20个异物同名案例，并支持整理出52个S-RNase和28个SFB等位基因组，将重建的完整S-locus数量从11个增加到19个。此外，鉴定出129个品种携带有与自交亲和性相关的Sc单倍型。总体而言，本研究为杏S-locus基因分型提供了一个高分辨率框架，并提供了一个基于序列的资源，以支持未来社区在命名协调方面的努力。

研究背景与意义：大多数温带果树作物表现出配子体自交不亲和性(GSI)机制，该机制阻止不亲和花粉管生长并促进远交。在李属物种中，该系统由多等位基因的S-locus(控制自交不亲和性的基因座)控制，包含作为雌性决定因子的S-RNase和作为雄性决定因子的S单倍型特异性F-box(SFB)基因。准确鉴定S等位基因对果树育种和果园设计至关重要。传统方法多依赖于基于聚合酶链反应(PCR)的分析，但PCR方法结合部分S等位基因测序，常因多个等位基因内含子长度相似而导致鉴定模糊或错误。此外，由于许多S等位基因仅有部分序列或mRNA数据，不同研究独立命名引发了大量同物异名或异物同名现象，造成严重歧义。尽管新一代测序(NGS)技术产生了大量杏基因组数据并揭示了新等位基因，但许多种质的S-locus基因型仍属未知。为解决这些问题，研究人员开展了基于NGS的高分辨率S-locus基因分型研究，旨在提供序列级验证、澄清模糊基因型并重建完整S-单倍型。该研究得出大量品种的基因分型新结果，并整理了等位基因命名，对指导果园配置和未来命名协调具有重要意义，论文发表在《Scientific Reports》。

关键技术方法：研究人员对来自新西兰、中国、中亚、印度、南部非洲、北部非洲、亚洲-高加索、东欧、西欧和北美洲的226个栽培杏品种样本队列开展了研究。主要技术方法包括：首先对公共数据库中的S-locus序列进行系统检索和多重序列比对，结合9个可用的杏参考基因组提取完整S-locus序列，构建合成参考序列；随后使用k-mer过滤算法对全基因组测序读段进行过滤，利用Bowtie2将读段映射至合成参考序列，基于覆盖广度进行自动化等位基因调用；最后通过PCR扩增和Sanger测序对部分结果进行验证，并利用系统发育树重建分析序列分歧。

研究结果：

S-locus等位基因命名的整理：研究人员通过比较文献和公共数据库中的S-RNase和SFB序列，整理了命名不一致问题。序列比较显示Sc和S8-RNase等位基因相同，因此被分组为S8/Sc等位基因组。同时确认了S3等位基因，而S5与S13-RNase序列相同，被归入S13等位基因组。研究共记录了22个潜在的同物异名案例和20个异物同名案例，最终整理出52个S-RNase和28个SFB等位基因组。

S-locus等位基因间序列分歧的结构：研究人员通过两两序列相似性分析和系统发育树重建发现，S-RNase和SFB序列的同一性并非均匀连续分布。S-RNase在不同组间同一性集中在约70-85%，组内则高于95%；SFB序列则呈现多峰模式，在70-78%、85-90%及大于95%处分别对应不同比较层级，中间存在明显的匮乏区。这一结构为区分高度相似的序列组和分歧更大的等位基因提供了定量基础。

S-locus的合成参考序列：研究人员为每个等位基因组选择最长的核苷酸序列构建了合成参考序列。通过整合参考基因组中的完整S单倍型，并利用226个基因分型种质的共现模式，将8对孤立的S-RNase/SFB序列成功关联，重建了8个新的单倍型，使重建的完整S-locus单倍型总数从11个增加到19个。该参考序列还包含了与自交亲和性相关的Sc单倍型及其FaSt MITE插入序列。

226个杏品种的S-locus基因分型与自交亲和性鉴定：研究人员应用上述流程对226个杏品种进行了基因分型。结果为187个品种分配了新的基因型，确认了30个已报告基因型，并发现9个与先前报告不同的案例。通过检查跨越SFB基因编码序列与FaSt MITE插入片段连接处的读段连续性，成功鉴定出129个携带Sc单倍型的品种。等位基因多样性从中国（22个）和中亚（23个）向西至欧洲逐渐递减。

讨论总结：基于全基因组测序的高分辨率S基因分型框架能够有效解决杏S-locus命名不一致的问题。尽管基于PCR的方法在常规基因分型中仍具速度和成本优势，但NGS方法在解析模糊基因型、检测未表征等位基因及重建S-单倍型方面具有不可替代的补充作用。通过记录冗余序列并重建孤立的SFB和S-RNase，本研究不仅扩展了杏授粉需求的信息，还为全球S等位基因多样性和Sc单倍型的主导地位提供了序列级证据。该研究提供了一个透明的比较框架，未来可扩展用于区分如嵌套FaSt插入和M-locus相关的自交亲和性突变，这将有助于推动S等位基因命名标准化的进程。