二甲双胍–姜黄素组合物的绿色分光光度测定方法：ICH验证与初步生物分析应用

《Scientific Reports》：Green spectrophotometric methods for the determination of metformin–curcumin combination: ICH validation and preliminary bioanalytical applications

　　

二甲双胍与姜黄素的联合治疗在糖尿病管理中受到越来越多的关注，这归因于二甲双胍的降糖作用以及姜黄素的抗氧化与抗炎活性。此种临床相关性亟需可靠的分析方法以实现二者的同步测定。研究人员开发并验证了三种简便、选择性好且经济高效的互补分光光度法，用于制剂及人血浆中二甲双胍与姜黄素的测定。零阶分光光度法可实现姜黄素的选择性测定；一阶导数法借助谱分辨提升实现两分析物的同步定量；比率减除法（ratio subtraction method, RSM）可在姜黄素共存下选择性测定二甲双胍，无需预先分离即可有效解决光谱重叠。所有方法在0.5–20.0 μg mL?1浓度范围内线性优异（r ≥ 0.999），检测限（limit of detection, LOD）与定量限（limit of quantitation, LOQ）分别为0.08–0.15 μg mL?1和0.23–0.45 μg mL?1。依ICH指南验证确认准确度、精密度与选择性满意；与参比法经Student t检验与F检验在95%置信水平无显著差异。所提方法成功用于原料药、加标姜黄素的二甲双胍制剂及加标人血浆，回收率98.73%–101.06%，相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）≤1.50%。绿色度评估显示环境相容性良好，支持其作为常规质量控制与生物分析的可持续分析工具。

研究背景方面，糖尿病管理中日渐重视二甲双胍（metformin, MET）与姜黄素（curcumin, CUR）联用，前者降糖、后者具抗氧化抗炎及抗糖化等多重获益，但二者光谱重叠且理化性质差异大，现有方法多为单独测定或仅限制剂的RP-HPLC，缺乏可同时测定且能拓展至生物基质的简便紫外分光光度法。研究人员据此首次建立三种单变量分光光度法并完成ICH验证与加标血浆概念验证。论文发表于《Scientific Reports》。

关键技术方法上，研究人员以乙醇为溶剂配制MET与CUR标准溶液，采用Shimadzu UV-1601 PC双光束紫外可见分光光度计（1 cm石英比色皿）采集200–600 nm光谱；零阶法于440 nm直测CUR（MET在此几乎无吸收）；一阶导数法以Δλ=4 nm、缩放因子10将光谱转一阶导，于245 nm（CUR零交点）测MET、467 nm（MET零交点）测CUR；比率减除法以10 μg mL^?1 CUR为除数作比谱、减常数后乘回除数重建MET零阶谱并于245 nm定量；生物基质实验使用埃及曼苏拉大学医院血库单人供体人血浆，乙醇沉淀蛋白、离心取上清稀释后测定。

研究结果部分，零阶分光光度法（Method I: direct spectrophotometry）借助CUR在440 nm特征峰且MET吸收可忽略，建立0.5–20.0 μg mL^?1线性校准，证实可直接选择性定量CUR并适用于加标血浆。一阶导数分光光度法（Method II: first-derivative spectrophotometry）利用零交点消除互扰，优化Δλ与缩放因子后，MET与CUR分别于245 nm和467 nm获线性响应，导数谱在加标血浆中与单药谱一致。比率减除法（Method III: ratio subtraction method, RSM）针对CUR谱带较宽的特点，以CUR为除数处理混合谱，减常恢复MET零阶谱，于245 nm定量MET，重建谱线性良好且无显著噪声放大，成功用于制剂与加标血浆中MET回收。

验证结果显示，线性范围0.5–20.0 μg mL^?1（r≥0.999），LOD 0.08–0.15 μg mL^?1、LOQ 0.23–0.45 μg mL^?1；准确度以纯药回收近100%体现，与文献RP-HPLC法t/F检验无显著差异；日内间精密度（2.5、5.0、10.0 μg mL^?1三浓度三联）RSD低；选择性经合成混合物、Glucophage?加标制剂及加标人血浆验证，辅料与血浆组分不干扰。应用结果表明，合成混合物与制剂加标回收98.73%–101.06%，加标人血浆中MET（临床峰浓度1.8–4.0 μg mL^?1）与CUR（0.19–0.60 μg mL^?1）均准确定量。绿色评估经ComplexMoGAPI（87分）、BAGI（82.5分）、AGREE（0.87）及多色评估（MA）确认高环境友好性， whiteness 71.6%。

讨论与结论部分指出，相较已有RP-HPLC法，所提分光光度法在灵敏度、线性范围相当或更优的前提下，兼具简便、快速、低成本与绿色优势，且唯一拓展至加标人血浆概念验证。研究人员结论为：三种分光光度法首次实现MET–CUR制剂同步测定并证明加标血浆适用性，性能满足ICH要求，为后续真实临床样本与药动学研究奠基；MET与CUR联用具代谢与抗炎协同潜力，可靠共存定量工具是支撑该组合物质控与生物分析的前提。