益生菌布拉氏酵母菌的代谢工程实现肠道3-羟基丁酸递送并改变小鼠短链脂肪酸谱

《Foods》：Metabolic Engineering of Probiotic Saccharomyces boulardii Enables Intestinal 3-Hydroxybutyrate Delivery and Alters Short-Chain Fatty Acid Profiles in Mice

　　

3-羟基丁酸（3-HB）是一种参与肠道炎症和代谢稳态调节的生物活性酮体。尽管工程化细菌益生菌已被开发用于局部3-HB递送，但其对抗菌抗生素的敏感性可能限制其在伴随抗生素治疗期间的使用。益生菌酵母布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）因其与抗菌抗生素的兼容性以及成熟基因工程工具的可及性，为肠道3-HB递送提供了替代宿主。在此，研究人员利用Cas9介导的基因组编辑技术将S. boulardii工程化以生产3-HB。将异源3-HB生物合成途径引入S. boulardii MYA-797，随后通过过表达ACS1、敲除ADH1和过表达ADH7对内源性乙酰辅酶A（acetyl-CoA）和乙醇代谢进行重编程。优化菌株SbDY02在微需氧条件下产生1.7 g/L的3-HB。与接受亲本菌株的小鼠相比，向C57BL/6J小鼠口服给予SbDY02使粪便3-HB和短链脂肪酸（SCFA）浓度分别增加1.89倍和1.68倍。重复给药还增加了粪便乙酸盐和循环总SCFA、丁酸盐和丙酸盐。在人结肠上皮细胞中，纯化的3-HB减弱了脂多糖（LPS）诱导的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，支持其直接作用于炎症相关上皮信号传导。据研究人员所知，这项研究首次展示了产3-HB的益生菌酵母，并将S. boulardii的中心代谢工程与增加的3-HB可用性、改变的SCFA谱以及宿主相关的上皮反应联系起来。

**论文解读：益生菌布拉氏酵母菌代谢工程实现肠道3-羟基丁酸递送并改变小鼠短链脂肪酸谱**

**1. 研究背景、问题与意义**

3-羟基丁酸（3-HB）是一种生物活性酮体，参与肠道炎症调节和代谢稳态维持。尽管工程化细菌益生菌（如大肠杆菌Nissle 1917）已被开发用于局部递送3-HB，但其对抗菌抗生素的敏感性限制了在伴随抗生素治疗期间的应用。益生菌酵母布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）具有抗生素兼容性、成熟的基因编辑工具和益生特性（如中和肠毒素、吸附病原体），可作为替代宿主。然而，此前尚未有研究将S. boulardii工程化用于生产3-HB，且产3-HB的益生菌酵母对肠道及循环短链脂肪酸（SCFA）谱的影响未知。因此，本研究旨在通过代谢工程改造S. boulardii实现局部3-HB递送，并评估其对肠道代谢环境的影响。该研究发表于《Foods》。

**2. 主要关键技术方法**

研究人员采用Cas9介导的CRISPR/Cas9基因组编辑系统，将三个密码子优化的异源基因（编码3-HB生物合成途径的RephaA、RephaB和EctesB）整合至S. boulardii MYA-797基因组，同时过表达内源乙酰辅酶A合成酶基因ACS1以增加前体供应。为减少乙醇竞争，依次敲除乙醇脱氢酶基因ADH1、ADH2、ADH5，并过表达ADH7以促进乙醇回收。优化菌株SbDY02在微需氧摇瓶培养条件下验证。动物实验使用来自Jackson Laboratory的25周龄雄性C57BL/6J小鼠，分为PBS对照组、野生型S. boulardii MYA-797组和SbDY02组，每日口服1×10⁹个细胞，分别于48小时和14天收集粪便和血浆样本。代谢物（3-HB、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐）采用液相色谱-三重四极杆质谱（LC/QQQ）分析。人结肠上皮HCT-8细胞用于体外实验，通过Western blot检测p38 MAPK磷酸化，RT-qPCR检测CXCL8 mRNA表达。

**3. 研究结果**

**3.1. Engineering S. boulardii for 3-HB Production**
通过将异源3-HB途径基因（RephaA、RephaB、EctesB）和过表达ACS1整合至S. boulardii MYA-797，获得菌株SbDY01。在含40 g/L葡萄糖的YP培养基中培养72小时，SbDY01产生0.8 g/L 3-HB，乙酸盐积累降至5.2 g/L，但乙醇积累仍达18.9 g/L，表明乙醇途径是主要竞争通路。

**3.2. Modulation of Alcohol Dehydrogenase Expression Enhances 3-HB Production**
敲除ADH1使乙醇积累降低37.7%（至11.8 g/L），3-HB滴度升至1.2 g/L，但甘油积累增加约4.4倍（至9.2 g/L）。进一步敲除ADH2或ADH5分别使3-HB升至1.5和1.4 g/L，但严重抑制生物量。过表达ADH7（催化乙醇转化为乙醛）部分恢复生长，乙醇降至9.8 g/L，3-HB达到最高1.7 g/L（菌株SbDY02），但甘油升至13.4 g/L，提示氧化还原不平衡仍是主要限制。

**3.3. Oral Administration of SbDY02 Alters Intestinal and Circulating Metabolite Profiles in Mice**
短期（48小时）给药后，SbDY02组粪便3-HB浓度显著高于PBS和野生型组，但SCFA（总SCFA、乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐）无显著差异；血浆代谢物均无变化。重复给药14天后，SbDY02组粪便3-HB持续升高，总SCFA中度增加，其中乙酸盐显著升高，而丁酸盐和丙酸盐无差异。血浆中3-HB无显著变化，但总SCFA、丁酸盐和丙酸盐显著升高，乙酸盐呈上升趋势。结果表明，SbDY02重复给药可增加肠道3-HB可用性，并改变粪便和循环SCFA谱。

**3.4. 3-HB Attenuates LPS-Induced p38 MAPK Activation in Human Colonic Epithelial Cells**
在HCT-8细胞中，LPS刺激增加p38磷酸化水平，而100 μM 3-HB预处理显著减弱该效应。同时，3-HB显著降低LPS诱导的促炎趋化因子CXCL8 mRNA表达，证实3-HB在低微摩尔浓度下具有抗炎活性，可直接调节宿主上皮信号通路。

**4. 讨论与结论总结**

讨论部分指出，本研究首次证明产3-HB的益生菌酵母，并通过中心代谢重编程实现了1.7 g/L的3-HB产量。口服SbDY02增加肠道3-HB并改变SCFA谱，但粪便与血浆SCFA变化的差异提示需进一步研究微生物组成、SCFA转运和宿主代谢。3-HB的体外抗炎作用支持其直接上皮活性，但缺乏体内炎症标志物验证和微生物组分析是主要局限。未来需开展长期安全性评估并解析机制。

**结论翻译**：在本研究中，研究人员通过将异源生物合成途径与内源性乙酰辅酶A和乙醇代谢重编程相结合，对益生菌酵母S. boulardii进行了工程化改造以生产3-HB。优化菌株SbDY02产生1.7 g/L 3-HB，并在小鼠口服给药后增加肠道3-HB可用性。SbDY02处理还与粪便和循环SCFA谱的改变相关，包括粪便乙酸盐以及循环丁酸盐和丙酸盐的升高。在HCT-8细胞中，3-HB还减弱了LPS诱导的p38 MAPK激活并降低CXCL8表达，支持其在上皮细胞水平的抗炎活性。然而，缺乏微生物组分析、全面的生物安全性评估以及对炎症反应的直接体内验证仍是局限性，需在后续研究中解决。据研究人员所知，本研究首次展示了产3-HB的益生菌酵母，并支持工程化S. boulardii作为局部肠道代谢物递送的潜在平台。