绿色溶剂基分散液-液微萃取结合高效液相色谱法测定谷物样品中三唑类杀菌剂

《Foods》：Green Solvent-Based Dispersive Liquid–Liquid Microextraction Method Coupled with High-Performance Liquid Chromatography for the Determination of Triazole Fungicides in Cereal Samples

　　

三唑类杀菌剂（triazole fungicides, TFs）因其强效的杀菌活性和广谱效力而被广泛用于谷物生产。然而，食品中TFs的残留可能对食品安全和人类健康构成风险。因此，开发高效且环境友好的样品前处理方法对于TFs的可靠测定至关重要。本研究开发了一种新型绿色溶剂基分散液-液微萃取结合高效液相色谱（dispersive liquid-liquid microextraction coupled with high-performance liquid chromatography, DLLME-HPLC）方法，用于谷物样品中TFs的测定。所制备的磁性低共熔溶剂（magnetic deep eutectic solvents, MDESs）由壬酸和氢氧化铁组成，作为绿色、磁响应性萃取溶剂，可在无需离心的情况下实现快速磁分离。研究人员考察了四种生物基溶剂（bio-based solvents, BBSs）作为绿色分散溶剂，以促进MDESs的分散并替代传统有毒有机分散剂，从而进一步增强萃取过程的环境可持续性。得益于疏水相互作用、氢键网络和磁响应性的协同效应，该方法实现了高效萃取和快速相分离，同时最大限度地减少了溶剂消耗和操作复杂性。采用多种绿色分析化学指标对方法的绿色度进行了评估，证实与传统DLLME方法相比，该方法具有较低的环境影响、较少的废物产生和更高的操作安全性。在优化条件下，该方法成功应用于大米、小麦、玉米、荞麦和燕麦样品中TFs的测定，回收率为75.0%–101.9%，相对标准偏差为1.6%–4.8%。所开发的DLLME方法为谷物农药残留分析提供了一种快速、灵敏且环境友好的策略，并拓展了MDESs和BBSs在绿色样品前处理中的应用。

### 论文解读：绿色溶剂基分散液-液微萃取-高效液相色谱法测定谷物中三唑类杀菌剂

**一、研究背景与问题**

三唑类杀菌剂（triazole fungicides, TFs）因其广谱、高效的杀菌活性，在谷物生产中应用极为广泛，其主要作用机制在于抑制麦角甾醇生物合成，从而破坏真菌细胞膜的完整性和功能。然而，TFs的长期大量使用不可避免地导致其在农产品中的残留累积。已有研究表明，TFs具有内分泌干扰效应、生殖毒性及潜在致癌性，食品中的残留TFs对人体健康构成潜在威胁。因此，建立灵敏、可靠且高效的谷物中TFs检测技术对保障食品安全具有重要意义。

谷物样品中农药残留的测定面临诸多挑战，其根本原因在于谷物提取物为含有大量蛋白质、脂质、碳水化合物等内源性化合物的复杂基质，而农药残留通常以痕量水平存在。因此，样品前处理在提高分析灵敏度、选择性和准确性方面发挥着至关重要的作用。传统前处理技术主要依赖液-液萃取（liquid-liquid extraction, LLE）和固相萃取（solid-phase extraction, SPE），但LLE操作繁琐且消耗大量有机溶剂，SPE虽减少了溶剂用量却依赖一次性萃取柱，导致运行成本升高和废物增加。液相微萃取（liquid-phase microextraction, LPME）因溶剂消耗少、操作简便和富集能力强而成为有吸引力的替代方案，其中分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME）因传质动力学快和萃取效率高而被广泛采用。

然而，DLLME的实际应用仍受限于微分散萃取液滴的高效回收难题。在DLLME中，萃取剂被分散为大量微滴以最大化界面接触并增强传质，虽显著提高了萃取效率，却也使后续相分离复杂化，通常需要离心辅助，这增加了分析时间并引入了对专用设备的依赖。为克服这一局限，磁性低共熔溶剂（magnetic deep eutectic solvents, MDESs）作为一类磁性功能溶剂被开发出来。MDESs通过在低共熔溶剂（deep eutectic solvents, DESs）体系中引入磁性组分，将萃取能力与磁响应性相结合，可在外部磁场下实现快速相分离而无需离心。然而，现有大多数MDESs基于氯化铁体系，往往表现出较弱的磁响应性和低效的磁性收集效率。此外，传统DLLME中使用的分散溶剂（如甲醇、乙腈、丙酮等）具有不同程度的毒性和环境风险，削弱了DLLME的环境可持续性。

**二、研究目的与创新点**

针对上述问题，本研究旨在开发一种全绿色溶剂基DLLME方法，用于谷物样品中三种代表性TFs的测定。本研究的创新点主要体现在以下两方面：其一，设计了一种以中链脂肪酸为氢键供体、金属氢氧化物为氢键受体兼磁响应源的新型疏水性MDES，相较于传统氯化铁基MDESs，氢氧化铁的引入不仅增强了磁响应性并加速磁分离，还提供了额外的配位位点，有助于维持DES的结构稳定性；其二，考察了四种生物基溶剂（bio-based solvents, BBSs）作为绿色分散溶剂替代传统有毒分散剂，包括二甲基异山梨醇（dimethyl isosorbide, DMI）、乳酸乙酯（ethyl lactate, EL）、2-甲基四氢呋喃（2-methyltetrahydrofuran, 2-MeTHF）和二氢左旋葡萄糖烯酮（Cyrene），以进一步提升样品前处理的绿色度。MDESs与BBSs的组合建立了一个全绿色DLLME平台，在降低环境影响、提高操作安全性和增强萃取性能方面具有显著优势。

**三、主要技术方法**

研究人员以壬酸与氢氧化铁（Fe(OH)?）按摩尔比5:1在80°C水浴中磁力搅拌加热30 min制备MDES。样本队列来源为太原当地市场购买的大米、小麦、玉米、荞麦和燕麦样品。萃取过程为：1 g谷物样品经1.5 mL DMI涡旋提取后，取1.3 mL提取液与300 μL MDES混合，加入7 mL水诱导相分离，涡旋60 s后以钕磁铁进行磁分离，收集的MDES相以HPLC级乙腈定容至300 μL后进行仪器分析。色谱分析采用Agilent 1260 Infinity III高效液相色谱系统（配二极管阵列检测器）和Agilent HC-C18色谱柱（250 × 4.6 mm, 3 μm），流动相为乙腈/水（51:49, v/v），流速1 mL min?1，柱温30°C，检测波长220 nm，进样量5 μL。方法的绿色度采用多种评估工具进行系统评价。

**四、主要研究结果**

**4.1 DLLME-HPLC条件的优化**

研究人员对脂肪酸类型、氢氧化物类型、摩尔比、MDES体积、BBS类型、BBS体积、水体积、氯化钠质量分数和pH九个参数进行了系统优化。结果表明：壬酸因其适宜的疏水性和粘度被选为最优脂肪酸；Fe(OH)?因具有最强的磁响应性和最低的生理毒性而被选为最优氢氧化物；壬酸与Fe(OH)?的摩尔比5:1在萃取能力与磁分离效率间达到最佳平衡；300 μL为最优MDES体积；DMI在四种BBSs及四种传统分散剂中表现最优；1500 μL DMI为最优分散剂体积；7 mL为最优水体积；NaCl的加入会干扰MDES与TFs间的氢键相互作用，因此不添加NaCl；在pH 3–11范围内，TFs的回收率保持稳定，因为三种TFs主要以分子形式存在，其分配行为不受pH显著影响。

**4.2 方法验证**

在最优条件下，该方法在0.001–0.1 μg g?1浓度范围内呈良好线性，相关系数（R2）为0.993–0.999。定量限（LOQ）和检出限（LOD）分别为0.001和0.0003 μg g?1。日内相对标准偏差（RSDs）为1.6%–4.5%，日间RSDs为1.7%–4.8%，表明方法具有良好的重复性和再现性。基质效应（matrix effect, ME）为86.1%–109.8%，在Codex Alimentarius委员会推荐的可接受范围内。

**4.3 实际样品分析**

将所建立的方法应用于大米、小麦、玉米、荞麦和燕麦五种谷物样品中TFs的测定。在0.001、0.01和0.1 μg g?1三个加标浓度水平下，TFs的回收率为75.0%–101.9%，证明该方法对复杂谷物基质中TFs的测定具有良好的适用性。

**4.4 绿色度评估**

采用七种互补的绿色评估指标对方法的可持续性进行了综合评价：AES评估得分89，表明分析过程的环境负担低；AGREEprep评估得分0.63，显示与可持续样品前处理实践的良好符合性；GEMAM评估得分3.796，反映总体可持续性令人满意；ComplexGAPI评估产生的E因子为3.9，体现了有效的废物最小化和最小的环境影响；SPMS评估得分7.89，证实了该方法在小型化、操作简便性和能源效率方面的优势；AGSA工具得分75.0；BAGI工具得分77.5。上述独立评估结果一致表明，所开发的DLLME-HPLC方法具有优异的环境可持续性，与绿色分析化学的核心原则高度契合。

**4.5 与其他方法的比较**

将所提出的DLLME-HPLC方法与文献报道的用于TFs测定的代表性微萃取方法进行比较发现，大多数已有方法涉及较复杂的萃取系统，需要使用有毒溶剂、磁性材料、表面活性剂或其他附加试剂，并借助涡旋混合器、离心机、超声波清洗器等辅助设备。相比之下，本研究提出的方法仅使用MDES作为萃取剂和DMI作为分散剂，通过简单的涡旋混合即可完成萃取过程。在分析性能方面，已有方法的LOQ范围为0.0003–0.009 μg mL?1，本方法实现0.001 μg g?1的LOQ；已有方法的回收率为63.4%–119.4%，RSDs一般低于18.5%，本方法实现75.0%–101.9%的回收率和1.6%–4.8%的RSDs。在适用性方面，已有研究主要集中于相对简单的液体基质，而本方法已成功应用于复杂谷物基质（大米、小麦、玉米、荞麦和燕麦）。这是首次专门针对谷物基质中TFs测定而开发和验证MDES-DLLME-HPLC方法的研究，填补了当前复杂样品分析方法学中的空白。

**五、讨论与结论**

本研究所开发的绿色溶剂基DLLME-HPLC方法成功实现了谷物样品中TFs的测定。新型疏水性MDES（基于壬酸和氢氧化铁）同时作为萃取介质和磁分离相，在实现高萃取效率的同时消除了离心步骤。BBSs作为分散溶剂有效替代了传统石油基溶剂，进一步增强了方法的环境可持续性。该策略在灵敏度、精密度和跨不同谷物基质的适用性方面均表现出令人满意的分析性能。多种绿色评估指标的系统评价证实了该方法具有低溶剂消耗、最小废物产生和简化操作等良好环境特性。MDESs与BBSs的结合为开发更绿色的微萃取系统提供了有效策略，同时减少了危险溶剂消耗并消除了相分离过程中的离心步骤。这项工作不仅为谷物中TFs的监测提供了可靠的分析手段，还拓展了新兴绿色溶剂在可持续样品前处理中的应用，为推进绿色分析化学提供了有前景的策略。