《Foods》：Nutritional Awareness of Extra Virgin Olive Oil: Empirical Evidence from Consumer Perceptions and Health Beliefs
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鸢乌贼（Sthenoteuthis oualaniensis）蛋白因致密的肌肉结构和较差的水分散性，限制了其作为食品配料的用途。本研究开发了一种以目标窗口峰面积（??target）作为肽分布响应的凝胶过滤色谱（GFC）导向的木瓜蛋白酶–碱
鸢乌贼（Sthenoteuthis oualaniensis）蛋白因致密的肌肉结构和较差的水分散性，限制了其作为食品配料的用途。本研究开发了一种以目标窗口峰面积（??target）作为肽分布响应的凝胶过滤色谱（GFC）导向的木瓜蛋白酶–碱性蛋白酶顺序水解策略。Box–Behnken优化确定了酶用量为1110 U/g、木瓜蛋白酶/碱性蛋白酶质量比为3:5、水解时间为8 h，得到??target为0.0648 ± 0.0012 a.u.。邻苯二甲醛（OPA）法测得的水解度（DH）值分别为SPH-Pap 10.72 ± 0.08%、SPH-Alc 35.32 ± 0.12%和SPH-opt 25.03 ± 0.37%，表明最高??target与最高DH并不一致。必需氨基酸占总氨基酸的比例保持在38.18–39.20%，而赖氨酸和甲硫氨酸变化较小。SPH-opt在宽pH范围内保持高溶解度，并呈现出与单一酶解产物不同的肽谱。仅对优化后的样品进行了自由基清除能力评估。在5 mg/mL浓度下，SPH-opt的DPPH和ABTS清除率分别为23.75%和22.84%；由于未使用外部标准品，这些数值仅支持研究内部的相对比较。总体而言，??target和DH在肽分布和键断裂方面提供了互补信息，但未建立??target与自由基清除能力之间的因果关系。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
鸢乌贼（Sthenoteuthis oualaniensis）是一种广泛分布于印度洋和太平洋的鱿鱼，因其生物量大、蛋白质含量高且脂肪含量低，被视为有前景的海洋生物资源。然而，其肌肉纤维排列紧密、质地坚韧，加之贮藏和加工过程中内源酶产生的异味，导致其当前利用主要局限于冷冻鱿鱼等初级产品。酶解技术可将大分子肌原纤维蛋白选择性切割为低分子量肽段，改善溶解性和功能特性，但现有研究多采用单一蛋白酶（如碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶），受限于酶切位点特异性，易出现蛋白降解不完全、目标肽段释放不足或过度水解生成过小肽段及游离氨基酸的问题。相比之下，组合酶或顺序水解可利用不同蛋白酶的互补切割偏好，重塑肽组成和功能特性。然而，目前酶解过程优化通常以水解度（DH）为主要评价指标，DH虽能反映整体肽键断裂程度，但无法提供特定分子量区段内肽段的相对丰度或肽群体分布信息。因此，需要一种能够反映肽分布调控的指标来补充DH的不足。
**研究目的与意义**
本研究提出一种基于凝胶过滤色谱（GFC）导向的顺序水解策略，以定义分布区间的峰面积（??
target）作为响应变量，优化木瓜蛋白酶–碱性蛋白酶对鸢乌贼蛋白的顺序水解条件。该策略旨在将过程评估从整体水解程度部分转向肽分布调控，从而为制备鸢乌贼蛋白水解物提供更特异的过程级依据。论文发表在《Foods》期刊。
**主要技术方法**
研究人员采用GFC导向的优化策略，以Sephadex G-25凝胶柱分离，定义K
av = 0.08–0.90为操作目标窗口，将220 nm吸收峰面积（??
target）作为响应变量。通过单因素实验筛选各阶段pH（木瓜蛋白酶pH 7.0、碱性蛋白酶pH 8.0），再利用Box–Behnken设计（BBD）优化总酶用量（1110 U/g）、木瓜蛋白酶/碱性蛋白酶质量比（3:5）和总水解时间（8 h）。制备单一酶解对照（SPH-Pap、SPH-Alc），并比较水解度（OPA法）、氨基酸组成、SDS-PAGE、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外光谱（UV）、差示扫描量热（DSC）、LC-MS/MS肽组学、粒径与Zeta电位、流变特性、pH依赖性溶解度、DPPH/ABTS自由基清除能力及乳化性。样本来源：鸢乌贼购自舟山中水渔业有限公司。
**研究结果**
**3.1 氨基酸组成**
ASP及三种水解物的总氨基酸含量为76.89–82.00 g/100 g，必需氨基酸比例（EAA/TAA）保持在38.18%–39.20%，各样品间差异微小。疏水氨基酸比例（HAA/TAA）为36.05%–37.63%，SPH-opt为37.47%。赖氨酸和甲硫氨酸在单个样品间有适度变化，但整体氨基酸组成差异不大，功能性质的变化更可能与水解诱导的肽段长度、序列组成和残基暴露有关。
**3.2 单因素条件筛选**
木瓜蛋白酶在pH 7.0时获得较高GFC目标窗口峰面积，碱性蛋白酶在pH 8.0时表现更佳。总酶用量和总水解时间对目标窗口峰面积呈先升后降趋势，最适值分别为1120 U/g和8 h。木瓜蛋白酶/碱性蛋白酶质量比为3:5时目标窗口峰面积最高（0.0642），表明合适的酶比例有利于目标窗口内肽组分的积累。
**3.3 响应面优化**
Box–Behnken设计拟合的二次多项式模型显著（模型F = 43.67，p < 0.0001），失拟项不显著（p = 0.9415），R2 = 0.9825。总酶用量（A）的线性项影响显著（p = 0.0292），而A2、B2、C2均极显著（p < 0.0001），表明存在非线性关系。最优条件为：总酶用量1107.67 U/g，木瓜蛋白酶/碱性蛋白酶质量比37.6%（约3:5），总水解时间7.968 h，预测??
target = 0.065。验证实验使用1110 U/g、3:5、8 h，实际??
target = 0.0648 ± 0.0012 a.u.，与预测值吻合。
**3.4 水解度**
SPH-Pap、SPH-Alc和SPH-opt的DH分别为10.72%、35.32%和25.03%，对应的??
target分别为0.0528、0.0485和0.0648 a.u.。SPH-Alc的DH最高，但??
target最低；SPH-opt的DH中等，但??
target最高，表明DH和??
target提供互补信息，而非相互替代。
**3.5 结构表征**
**3.5.1 SDS-PAGE**：ASP显示35–250 kDa的多条蛋白带。酶解后高分子量带显著减弱，SPH-Alc和SPH-opt中几乎消失。SPH-opt在低分子量区域呈现连续弥散分布，表明顺序水解有效降解大分子蛋白并生成以低分子量肽为主的水解物。
**3.5.2 FTIR**：酰胺I带峰位从ASP的1654.14 cm?1轻微移至SPH-opt的1652.21 cm?1。高斯拟合显示，SPH-opt的β-转角含量降至19.70%，无规卷曲和β-折叠分别增至25.15%和30.19%，表明顺序水解使二级结构重新分布，但与SPH-Pap和SPH-Alc模式不同。
**3.5.3 UV光谱**：SPH-opt在280 nm附近吸收增强，暗示芳香族氨基酸残基微环境改变；220–240 nm区域吸收变化与肽键吸收和短肽形成一致。
**3.5.4 DSC**：ASP主热转变峰约88.95 °C，SPH-opt主峰约90.95 °C，介于SPH-Pap和SPH-Alc之间，表明顺序水解改变了热响应行为，但未简单增加或降低热稳定性。
**3.5.5 肽组学**：LC-MS/MS显示SPH-opt肽分布介于两种单一酶解物之间，具有独特的肽长度分布和特征序列。与SPH-Alc相比，SPH-opt中FNW、DFWDGRDGDVDAA、NWDDMEKIWHH等肽段相对响应高3.64–52.2倍，AKSLYDRMFNW在SPH-Alc中未检出。这些肽段含芳香族残基，但需进一步验证其抗氧化活性。
**3.6 物理性质**
**3.6.1 粒径与Zeta电位**：ASP平均粒径约50 μm，水解后降至纳米级。SPH-opt平均粒径189.2 nm，小于SPH-Alc（520.6 nm），PDI更低。Zeta电位：SPH-Pap为?32.73 mV，SPH-opt为?3.20 mV，表明其分散稳定性不主要依赖静电排斥。
**3.6.2 流变性质**：ASP在低剪切速率下粘度高达107.336 Pa·s，呈剪切稀化。水解物粘度显著降低，SPH-opt在低剪切区粘度（0.115 Pa·s）高于其他水解物，但在高剪切区（1000 s?1）降至0.00125 Pa·s，低于SPH-Pap和SPH-Alc。
**3.7 功能性质**
**3.7.1 pH依赖性溶解度**：ASP在pH 4.0几乎不溶，pH 6.0溶解度仅11.7%。SPH-opt在pH 2.0–10.0范围内保持100%溶解度，pH 12.0仍达93.4%，优于SPH-Pap（90.1–99.2%）和SPH-Alc（pH 2.0时86.1%）。
**3.7.2 DPPH和ABTS自由基清除能力**：在5 mg/mL时，SPH-opt的DPPH和ABTS清除率分别为23.75%和22.84%，略高于SPH-Pap和SPH-Alc。由于未使用外部标准品，结果仅用于研究内部相对比较，不能表征绝对抗氧化效力。
**3.7.3 乳化活性与乳液稳定性**：SPH-Pap的乳化活性指数（EAI）最高（8.26 m2/g），SPH-opt为6.21 m2/g，显著低于SPH-Pap。乳液稳定性指数（ESI）方面，SPH-opt最高（20.98 min），高于ASP（20.45 min）、SPH-Pap（18.30 min）和SPH-Alc（17.87 min），但仅与SPH-Pap相比有显著差异。
**讨论与结论**
讨论部分指出，DH和??
target的错配表明两者在反映肽键断裂和肽分布方面互补，而非可互换。SPH-opt的中间DH与最高??
target同时出现，提示顺序水解有利于目标窗口内可溶性组分的积累，但这一关联不构成因果关系。功能性质（自由基清除、乳化性）在优化后测定，未作为响应面变量，因此不能证明优化??
target也优化了抗氧化性能。研究局限性包括：蛋白质当量由氨基酸组成估算、缺少逆向顺序和同时双酶对照、缺乏定量肽组学和单个肽活性验证。未来需补充总氮归一化、定量肽组学、活性导向分级、纯化/合成肽测试以及细胞和食品基质验证。
**结论（翻译）**
本研究将GFC目标窗口峰面积（??
target）作为肽分布导向的操作指标，用于优化鸢乌贼蛋白的木瓜蛋白酶–碱性蛋白酶顺序水解。在优选条件（1110 U/g干ASP、木瓜蛋白酶/碱性蛋白酶质量比3:5、总水解时间8 h）下，??
target达到0.0648 ± 0.0012 a.u.。SPH-Alc的OPA法DH最高，而SPH-opt的??
target最高，表明DH和??
target在整体肽键断裂和GFC窗口内肽分布方面提供互补信息。与测试的单一酶解产物相比，SPH-opt残留高分子量组分少，在测试pH范围内溶解度较高，LC-MS/MS肽谱独特，且ESI数值最高。但功能性质在过程优化后评估，未作为响应面变量；此外，由于未包含外部抗氧化标准品或IC??测定，自由基清除结果仅支持研究内部相对比较。因此，本结果未建立??
target、肽组成与功能性能之间的因果关系。本研究的主要局限性包括蛋白质当量由氨基酸组成估算、缺少逆向顺序和同时双酶对照、以及缺乏定量肽组学和单个肽活性的直接验证。未来研究应包含总氮归一化、定量肽组学、活性导向分级、纯化或合成肽的直接测试，以及细胞和食品基质系统的验证。还应考察界面性质和乳液微观结构，以阐明EAI与ESI之间的差异。
