脊髓感觉突触招募BRAF促进神经病理性疼痛的机制：通过增强跨突触NMDA受体活性

《Science Signaling》：BRAF recruitment to spinal sensory synapses promotes neuropathic pain by potentiating transsynaptic NMDA receptor activity

　　

慢性神经病理性疼痛状态下，脊髓背角突触NMDA受体（N-methyl-D-aspartate受体，NMDAR）的持续过度兴奋是核心特征。研究人员发现激酶BRAF是该过程的关键调控因子。大鼠脊神经损伤诱导BRAF从背根神经节（DRG）转位至脊髓突触体，伴随下游MEK与ERK磷酸化增强。在鼠与人的脊髓样本中，损伤亦增加NMDAR与BRAF/MEK/ERK复合物的相互作用。在小鼠DRG神经元中药物抑制或基因敲除BRAF，可逆转神经损伤诱导的NMDAR磷酸化、突触转运及脊髓背角突触前与突触后过度兴奋。野生型小鼠损伤后痛觉超敏持续存在，而DRG神经元缺失BRAF或经BRAF通路抑制剂处理的小鼠痛觉超敏短暂且较轻。反之，在DRG神经元表达组成型活化BRAF突变体可诱导持续性伤害性超敏，该表型被NMDAR拮抗剂、加巴喷丁或α2δ-1 C端干扰肽阻断，并伴脊髓NMDAR磷酸化与突触前/后活性增强。上述结果揭示感觉神经元BRAF通过增强NMDAR磷酸化与跨突触过度兴奋促进神经病理性疼痛，提示BRAF抑制剂可重定位用于镇痛。

研究背景方面，慢性神经病理性疼痛是全球重大健康负担，源于神经损伤、感染、代谢异常或肿瘤治疗等，传统镇痛药疗效有限。脊髓背角初级传入-投射神经元突触的NMDAR在正常状态下受LRRC8A等锚定呈潜伏态，损伤后突触前/后NMDAR张力性激活，放大痛觉传导。NMDAR磷酸化增强其突触定位与活性，既往认为PKC、Src/Fyn、CK2等激酶参与，但因基础功能广泛而临床耐受差。RAF家族中BRAF是最强MEK激活剂，且在神经元突触高度富集，但在神经病理性疼痛中作用未知。本研究即围绕“BRAF是否及如何调控脊髓感觉突触NMDAR过度兴奋”展开。论文发表于《Science Signaling》。

主要关键技术方法包括：使用大鼠脊神经结扎（SNL）与小鼠保留性神经损伤（SNI）模型，辅以背根切断验证转位来源；构建DRG神经元特异性Braf条件敲除（Braf-cKO）与组成型活化Braf^V600E条件敲入（Braf^V600E-cKI）小鼠（Avil^iCre/ERT2+驱动）；应用BRAF抑制剂vemurafenib、MEK抑制剂selumetinib、Braf siRNA鞘内给药及电生理记录脊髓背角II层神经元微小兴奋性突触后电流（mEPSC）与诱发性EPSC；采用突触体分离、免疫沉淀（抗GluN1、抗BRAF、抗磷酸丝氨酸）、免疫印迹及人脊髓组织（马里兰脑库供体）验证保守性。

研究结果部分，“Nerve injury induces translocation of BRAF from the DRG to spinal cord synapses”小节中，SNL后DRG内BRAF蛋白下降而脊髓突触体BRAF上升，Braf mRNA不变；背根切断消除脊髓突触体BRAF增加，证明损伤促BRAF从DRG胞体顺向转位至中枢末梢。“Nerve injury increases BRAF activity in spinal cord synaptosomes but not the DRG”小节显示SNL选择性升高脊髓（非DRG）pMEK/pERK，vemurafenib抑制该效应。“Inhibiting BRAF or MEK activity reverses nerve injury–induced pain hypersensitivity”与“BRAF at the spinal cord level mediates nerve injury–induced neuropathic pain”小节表明腹腔vemurafenib、selumetinib及鞘内Braf siRNA剂量依赖性地逆转SNL大鼠机械、压力与热超敏，且不影响假手术组。“Nerve injury increases phosphorylation and synaptic trafficking of NMDARs in the spinal cord through BRAF”小节证实vemurafenib降低SNL诱导的GluN1丝氨酸磷酸化与突触体GluN1富集。“Nerve injury promotes synaptic expression and interaction between BRAF signaling complexes and NMDARs in the spinal cord”小节通过Co-IP显示SNL增强GluN1-BRAF/MEK/ERK复合物在脊髓（含人样本）突触体中的结合。“BRAF mediates nerve injury–induced synaptic NMDAR hyperactivity in the spinal dorsal horn”小节电生理表明vemurafenib预处理使SNL切片mEPSC频率回至假手术水平，AP5无额外作用；NMDA puff电流增大被vemurafenib取消。“Genetic ablation of Braf in primary sensory neurons blunts…translocation…”小节中Braf-cKO小鼠SNI后超敏在3–4周消退（野生型持续>4周），且脊髓突触体BRAF/pMEK/pERK/GluN1磷酸化不升高。“Ablation of Braf in primary sensory neurons prevents…MEK/ERK hyperactivity, NMDAR phosphorylation…”进一步确认DRG来源BRAF是脊髓NMDAR磷酸化与定位的上游必要因素。“Braf deletion…blocks…presynaptic and postsynaptic NMDAR hyperactivity”小节显示cKO消除SNI引起的mEPSC频率增高、诱发EPSC幅度增高与配对脉冲比（PPR）下降及AP5效应，也取消NMDA puff电流增强。“Expressing constitutively active BRAF in DRG neurons augments BRAF activity…induces persistent pain hypersensitivity”小节中Braf^V600E-cKI小鼠自发痛超敏>3周，被vemurafenib/selumetinib逆转。“Genetic induction…induces sustained pain hypersensitivity through α2δ-1–bound NMDARs”小节证明AP5、memantine、加巴喷丁及α2δ-1 C端干扰肽均可缓解cKI痛超敏，提示α2δ-1结合NMDAR介导。“Selective activation of BRAF in DRG neurons increases phosphorylation and synaptic trafficking of α2δ-1–bound NMDARs”小节显示cKI小鼠脊髓突触体GluN1磷酸化与GluN1免疫沉淀中α2δ-1量增高。“Selective activation…induces transsynaptic NMDAR hyperactivity”小节电生理证实cKI小鼠mEPSC频率、诱发EPSC/PPR及NMDA puff电流异常均依赖NMDAR。

讨论与结论翻译：本研究揭示初级感觉神经元BRAF信号在神经病理性疼痛中的关键作用。神经损伤不提高DRG内BRAF活性，但促其转位至脊髓突触，通过BRAF-MEK-ERK轴增强GluN1磷酸化、α2δ-1–NMDAR结合与突触定位，导致突触前（末梢释放增强、mEPSC频率增、PPR降）与突触后（NMDA电流增大）跨突触过度兴奋。DRG特异性Braf缺失阻断该级联，Braf^V600E敲入足以重现损伤表型。BRAF是连接神经损伤与脊髓NMDAR中枢敏化的上游空间特异性开关。已获肿瘤适应症的BRAF/MEK抑制剂（如vemurafenib、dabrafenib、selumetinib）可重定位用于难治性神经病理性疼痛，鞘内递送或可减毒。该研究从突触激酶转位视角为镇痛靶点开发提供机制依据。