IVF实验室操作期间环境条件对精子质量的影响

《International Journal of Molecular Sciences》：Impact of Environmental Conditions During IVF Laboratory Handling on Sperm Quality

　　

精子因其有限的抗氧化能力和DNA修复机制，对环境应激高度敏感。在辅助生殖技术（ART）操作过程中，精液样本暴露于各种实验室条件下；然而，现行指南对精子处理的最佳环境参数建议有限。本研究旨在评估ART实验室中遇到的环境因素对经典精子参数（总活力、前向运动力和存活率）及功能性标志物（包括氧化还原电位（ORP）和DNA碎片化（DF））的影响。研究人员将形态学正常精子（n = 8）的原始精液样本暴露于不同温度（4、24、37和?80 °C）、氧浓度（21%和5%）、可见光或紫外（UV）光以及离心（400× g）下1小时。UV照射和?80 °C暴露对经典精子参数产生最不利的影响。虽然?80 °C未显著影响ORP或DF，但UV照射引起这两项参数最显著的升高。5% O₂和4 °C比常规实验室条件（21% O₂、24 °C、37 °C）更有效地保持了多项精子质量参数。这些发现表明，即使是短期暴露于各种实验室条件也能显著影响精子质量。因此，在ART期间改变精子处理时的环境条件可能有助于保护精子功能。

**论文解读：IVF实验室环境条件对精子质量的影响**

**1. 研究背景与问题**

精子是高度特化的细胞，其成熟过程中丢失了多数细胞器（如高尔基体、内质网、核糖体）以及关键的细胞机制，包括强大的抗氧化防御系统和DNA修复机制。因此，成熟精子极易受氧化应激（OS）损伤。生理条件下，适量活性氧（ROS）参与信号转导、DNA浓缩、获能、超激活、顶体反应及精卵融合等正常过程；但ROS过量则会导致DNA碎片化（DF）、脂质过氧化、膜完整性破坏、酶失活及凋亡，最终损害精子参数。精子膜富含多不饱和脂肪酸（PUFA），易被ROS攻击，生成丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4HNE）等毒性产物，破坏能量代谢和线粒体功能。此外，精子染色质高度浓缩，但成熟精子DNA修复能力有限，氧化损伤后主要依赖卵母细胞修复。在辅助生殖技术（ART）中，精液样本常需在体外处理，暴露于温度波动、光照、大气氧分压、机械力（如离心）等环境因素。尽管现有指南对精子处理有所建议，但关于最佳温度、光照和氧浓度的具体定量推荐仍然不足。既往研究多孤立考察单一应激源，且暴露时间常长于临床常规操作，与IVF实验室实际条件不符。因此，本研究旨在同一射精样本内系统比较短时（1 h）多种实验室相关环境条件对经典精子参数及功能性标志物（ORP和DF）的影响，以识别应优先避免或改良的操作条件。

**2. 主要技术方法**

研究人员招募了8名接受生育力评估的男性，其精液样本均符合WHO第5版正常精子参考标准（>15 M/mL）。实验设置包括：0 h对照组（未处理）；24 °C暗处闭盖孵育1 h；37 °C暗处闭盖孵育1 h；4 °C暗处闭盖孵育1 h；?80 °C暗处闭盖孵育1 h；37 °C开盖21% O₂孵育1 h；37 °C开盖5% O₂孵育1 h；室温可见光（白炽灯，60 W，2700 K）闭盖孵育1 h；室温UV-C（254 nm）开盖孵育1 h；400× g离心1 h（暗处闭盖）。处理后重新评估精子总活力、前向运动力、存活率、DNA碎片化（DF）和氧化还原电位（ORP）。DF采用精子染色质结构分析（SCSA）试剂盒结合流式细胞术测定；ORP采用MiOXSYS系统（电化学传感器）测量静态ORP（sORP）。统计学上，因数据非正态分布，采用Friedman检验及Bonferroni-Holm事后检验进行多组比较，并计算Kendall协同系数（W）评估效应量。

**3. 研究结果**

**3.1 温度**
与0 h相比，除4 °C外，其他温度均显著降低总活力（p < 0.001），?80 °C降幅最大；4 °C反而显著增加总活力（p < 0.05）。但前向运动力在4 °C也显著下降（p < 0.001）。与24 °C相比，37 °C轻度但显著降低总活力（p < 0.05），?80 °C急剧降低（p < 0.001），4 °C则显著提高总活力（p < 0.001）。所有温度均显著降低存活率，?80 °C最严重；但4 °C比24 °C稍好，?80 °C则明显更差。ORP在37 °C升高（p < 0.001），4 °C降低（p < 0.001）；DF仅在37 °C出现轻度显著升高（p < 0.05）。

**3.2 氧浓度**
与0 h相比，21%和5% O₂均显著降低总活力、前向运动力和存活率（p < 0.001）。与37 °C对照相比，5% O₂显著更好地维持总活力（p < 0.05）和前向运动力（p < 0.001）；21% O₂对存活率的降低作用更显著（p < 0.001 vs. 5% O₂ p < 0.05）。直接比较显示，5% O₂的总活力和存活率显著高于21% O₂（p < 0.001）。ORP在两种氧浓度下均较0 h显著升高（p < 0.001），但仅21% O₂显著高于37 °C对照（p < 0.001），5%与21%间无显著差异。DF仅在21% O₂下较0 h显著升高（p < 0.05），且5% O₂的DF显著低于21% O₂（p < 0.05）。

**3.3 光照暴露**
暗环境（24 °C）和可见光均较0 h显著降低总活力和前向运动力（p < 0.001），UV暴露则导致急剧下降；可见光与暗环境间无显著差异，UV显著差于两者（p < 0.001）。三种光照条件均显著降低存活率（p < 0.001），可见光和UV均显著低于暗环境，且UV比可见光更严重（p < 0.01）。ORP在可见光下轻度降低（p < 0.05），UV下显著升高（p < 0.001），UV的ORP显著高于暗环境和可见光（p < 0.001）。DF仅在UV下较0 h显著升高（p < 0.001）；与暗环境相比，可见光已轻度升高DF（p < 0.05），UV升高更显著（p < 0.001）。

**3.4 离心**
400× g离心1 h显著降低总活力和前向运动力（p < 0.001 vs. 0 h），与24 °C相比仅总活力出现轻度显著下降（p < 0.05）。存活率较两个对照均显著降低（p < 0.001）。ORP无显著变化。DF较24 °C对照轻度显著升高（p < 0.05）。

**3.5 ORP与DFI的关系**
Spearman相关分析显示，ORP与DFI之间存在强正相关（Spearman’s rho = 0.7316，p < 0.001），提示氧化应激水平升高与精子DNA损伤增加相关。

**4. 讨论与结论**

研究证实，短时暴露于不同实验室环境即可显著影响精子质量。UV照射和?80 °C无保护剂暴露对精子参数损害最重，且UV显著升高ORP和DFI，提示氧化应激和DNA损伤加剧。?80 °C虽未显著影响ORP或DFI，但严重损害活力与存活率，归因于无冷冻保护剂时冰晶形成造成的细胞损伤。相比之下，5% O₂和4 °C短时孵育比常规条件（21% O₂、24 °C、37 °C）更能维持某些精子参数。生理性低氧（5%）更接近女性生殖道内氧环境（2–8%），可减少氧化损伤；4 °C通过降低代谢活动、保存能量储备发挥保护作用，但需避免快速冷却引起的“冷休克”。可见光虽损害较轻，但长时间照射（1 h）也可降低存活率并轻度升高DF，提示应尽量减少不必要的光暴露。离心时间比离心力对ROS产生的影响更大，延长离心时间可能加重精子损伤。研究局限包括样本量小（n = 8）、暴露时间仅1 h、部分条件（?80 °C、UV）为实验性应激而非临床常规，且未评估临床生殖结局。总之，在精子处理过程中应尽量减少不必要的温度波动、过长大气氧暴露、过度光照和长时间离心。现有指南对这些参数的定量规定仍然有限，本研究为IVF实验室优化精子处理条件提供了实验依据，有助于在ART期间保护精子功能。