基于昆虫（黄粉虫）日粮喂养大鼠的肠道环境功能活性与代谢谱的综合评估

《International Journal of Molecular Sciences》：Integrated Assessment of the Functional Activity of the Gut Environment and Metabolic Profiles in Rats Fed an Insect-Based (Tenebrio molitor) Diet

　　

摘要：可食用昆虫作为可持续蛋白质来源在动物营养中的应用日益受到关注，但其对肠道微生物功能、肠道安全性及全身代谢的影响仍需全面评估。本研究比较了含35%黄粉虫（Tenebrio molitor）粉日粮、含鸡水解物日粮及标准实验室日粮对大鼠肠道环境功能活性和宿主代谢谱的影响。雌性Wistar大鼠饲喂实验日粮60天，随后评估粪便短链脂肪酸（SCFAs）、微生物酶活性、粪便水遗传毒性以及肝脏和脾脏代谢组。饲喂黄粉虫日粮的大鼠粪便中主要短链脂肪酸（包括乙酸盐、丁酸盐、戊酸盐和支链脂肪酸（BCFAs））浓度显著降低，表明结肠发酵发生改变。β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性在不同组间均存在显著差异，且在黄粉虫组中最高。β-葡萄糖醛酸酶活性随时间下降，但未观察到显著的组别与时间交互作用。黄粉虫组粪便水遗传毒性随时间显著降低。非靶向超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC–HRMS）代谢组学揭示出显著的日粮依赖性代谢物谱差异。在肝脏中，昆虫基日粮与甘油磷脂代谢、初级胆汁酸生物合成和嘧啶代谢通路的富集相关，同时核黄素和苯丙氨酸相关通路的代谢物丰度较低。在脾脏中，日粮相关差异涉及脂质相关通路（包括甘油磷脂、亚油酸和类固醇相关代谢）以及核苷酸相关通路的代谢物。这些发现支持对完整昆虫基配方进行进一步评估，并强调了在评价昆虫基饲料的安全性和生理影响时应考虑的具体代谢通路。

基于昆虫（黄粉虫）日粮喂养大鼠的肠道环境功能活性与代谢谱的综合评估——论文解读

一、研究背景与目的

随着全球人口增长与资源环境压力加剧，寻找可持续的蛋白质替代来源已成为动物营养领域的重要研究方向。可食用昆虫因其资源利用效率高、营养组成优良而被广泛关注，其中黄粉虫（Tenebrio molitor）幼虫富含粗蛋白（干基约50–60%）、不饱和脂肪酸、甲壳素纤维及B族维生素和矿物质，被认为是单胃动物（家禽、猪、鱼、犬、猫）日粮中豆粕或鱼粉等常规蛋白源的可行替代品。然而，尽管已有研究证实昆虫粉可在不影响生长性能的前提下替代常规蛋白源，并调节肠道形态、微生物群和免疫指标，但关于高比例昆虫日粮对哺乳动物肠道微生物功能、肠道安全性及全身系统性代谢的综合影响仍缺乏系统评估。

目前该领域存在以下关键问题：其一，已有研究多集中于生长性能和营养消化率，同时采用肠道功能生物标志物（短链脂肪酸、粪便酶活、遗传毒性）与系统代谢组学终点的综合性研究较少；其二，关于昆虫基日粮对粪便水遗传毒性的影响尚无报道；其三，摄入昆虫粉后的系统性代谢效应，尤其是通过器官代谢组学测定的肝脏和脾脏代谢变化，仍未得到充分表征。鉴于这些空白，研究人员开展了一项整合式多参数评估，以Wistar大鼠为单胃动物模型，比较含35%黄粉虫粉日粮、鸡水解物日粮和标准实验室日粮对肠道环境功能活性（粪便SCFAs、β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性、粪便水遗传毒性）和宿主器官代谢谱（肝脏和脾脏代谢组）的影响。该研究首次在哺乳动物中评估了黄粉虫摄入后的粪便水遗传毒性，并首次对昆虫基日粮诱导的脾脏代谢组进行了表征，旨在为蟋蟀基完整配方饲料的安全性评估和生理学意义提供多参数科学依据。

二、主要技术方法

本研究采用多项互补分析技术：通过高效液相色谱法（HPLC）测定粪便中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸等短链脂肪酸浓度；采用分光光度比色法测定粪便β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性（以每毫克蛋白的毫摩尔数表示）；应用碱性单细胞凝胶电泳（彗星实验）评估大鼠正常小肠上皮IEC-6细胞暴露于粪便水后的DNA损伤百分比，作为粪便水遗传毒性指标；采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QToF-MS）对肝脏和脾脏组织提取物进行非靶向代谢组学分析，结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行多变量统计，并通过通路富集分析和化学类别富集分析鉴定差异代谢通路。实验采用雌性Wistar大鼠（12月龄，250–280 g，n=45），随机分为3组（每组15只）：A组（35%黄粉虫粉日粮）、B组（鸡水解物日粮，阳性对照）和C组（标准实验室日粮，阴性对照），单笼饲养，实验期60天。日粮依据欧洲宠物食品工业联合会（FEDIAF）营养推荐配制，实验经当地伦理委员会批准。

三、研究结果

1. 粪便酶和短链脂肪酸分析

β-葡萄糖醛酸酶活性在8周实验期间总体随时间下降，且饮食组间差异显著。重复测量方差分析显示时间和组别的主效应均显著，但组别与时间交互作用不显著。A组（35%黄粉虫组）的平均酶活性范围（0.000571–0.000883 mmol/mg蛋白质）持续高于B组（0.000200–0.000434 mmol/mg蛋白质）和C组（0.000221–0.000366 mmol/mg蛋白质）。β-葡萄糖苷酶活性在饮食组间差异显著，但随时间保持相对稳定，组别主效应显著，而时间和交互作用不显著；A组值最高（0.00299–0.00405 mmol/mg蛋白质）。

短链脂肪酸分析显示，A组甲酸（11.71–17.17 mg/g）、乙酸（12.17–15.97 mg/g）、丁酸（11.38–26.06 mg/g）、异戊酸（8.72–11.46 mg/g）和戊酸（5.86–8.16 mg/g）浓度均低于B组和C组。组别对甲酸、乙酸、丁酸、异戊酸和戊酸有显著影响；时间对甲酸、乙酸、丙酸和丁酸有显著影响；仅丁酸表现出显著的组别与时间交互作用。支链脂肪酸（BCFAs）在A组中维持最低水平。此外，乙酸与其余短链脂肪酸总和之间关系的斜率在C组显著高于A组和B组；戊酸与其余酸总和的斜率在C组为正值，而B组接近零且显著不同于C组，表明不同日粮下脂肪酸间的关联模式存在差异。

2. 粪便水遗传毒性评估

在A组中，粪便水遗传毒性随时间显著降低，第6周时降幅最大（约6倍）；B组遗传毒性相对稳定，仅在第8周略有下降；C组在第6周升高后第8周略降。统计分析显示组别效应和组别与时间交互效应均显著。第4周和第6周时，所有组间差异均显著（p < 0.001），B组遗传毒性最高，C组（第4周）和A组（第6周）最低；第8周时B组仍显著高于A组和C组，而A组和C组间无显著差异。多变量回归分析显示，在第6周时组别与遗传毒性显著相关，甲酸与遗传毒性呈正相关，丁酸呈负相关；在第8周时丁酸仍与遗传毒性呈负相关。饮食组是遗传毒性的主导解释因素。

3. 肝脏代谢组学

无监督PCA分析显示，A组（AW）肝脏样本与B组（BW）有分离趋势，并与C组（CW）明显分离；有监督OPLS-DA进一步确认了AW与BW及AW与CW之间的清晰稳定分离。通路富集分析表明，与BW相比，AW中高丰度代谢物显著富集于甘油磷脂代谢、嘧啶代谢和初级胆汁酸生物合成通路；低丰度代谢物主要与核黄素代谢和苯丙氨酸代谢相关。与CW相比，AW中高丰度代谢物涉及嘧啶代谢、核黄素代谢和初级胆汁酸生物合成；CW中高丰度代谢物则与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢及类固醇激素生物合成相关，其中支链氨基酸生物合成具有最高的统计显著性和通路影响。化学类别富集分析显示，AW中高丰度代谢物主要为嘧啶核苷类、羟基酸及其衍生物、有机氮化合物、类固醇及其衍生物和脂肪酰基类；低丰度代谢物则以黄素核苷酸、羧酸及其衍生物、有机硫酸及其衍生物和嘌呤核苷酸为主。

4. 脾脏代谢组学

PCA分析显示AS与BS以及AS与CS之间存在脾脏代谢谱差异；OPLS-DA确认了清晰的组间分离。通路富集分析表明，与BS相比，AS中高丰度代谢物富集于甘油磷脂代谢、初级胆汁酸生物合成和亚油酸代谢；BS中高丰度代谢物主要与组氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成及赖氨酸降解相关。与CS相比，AS中高丰度代谢物涉及类固醇激素生物合成和苯丙氨酸代谢；CS中高丰度代谢物则与组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成相关，其中组氨酸代谢的统计显著性最高。化学类别富集分析显示，AS中高丰度代谢物主要涉及嘧啶核苷类、羟基酸及其衍生物、咪唑并嘧啶类、类固醇及其衍生物等；CS中高丰度代谢物主要为核糖核苷3′-磷酸、有机碳酸及其衍生物、嘌呤核苷类、四吡咯及其衍生物等。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，含35%黄粉虫粉的日粮显著改变了结肠发酵模式，表现为粪便中甲酸、乙酸、丁酸、戊酸和支链脂肪酸浓度降低，同时β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性升高。黄粉虫粉提供的大量甲壳素可能降低营养物质消化率并作为不易被哺乳动物肠道微生物发酵的底物，从而导致短链脂肪酸产量下降。丁酸作为结肠上皮细胞的主要能量来源和肠道屏障完整性的重要维持因子，其浓度降低应被视为潜在的负面结果；但与此同时，粪便水遗传毒性的显著降低提示肠道内遗传毒性负担有所减轻。肠道健康最终效应取决于降低的遗传毒性与减少的丁酸产量之间的平衡，尚需进一步研究肠道屏障功能和炎症标志物加以阐明。

代谢组学分析显示，肝脏中主要差异涉及脂质、胆汁酸、核苷酸、氨基酸和维生素辅因子相关代谢通路。甘油磷脂代谢和初级胆汁酸生物合成的富集与黄粉虫粉的高脂含量一致，并与既往报道的昆虫粉降脂效应相符；嘧啶代谢的富集可能反映完整昆虫粉中核酸化合物的较高摄入；苯丙氨酸代谢及支链氨基酸生物合成的差异可能反映完整昆虫蛋白与水解鸡蛋白在消化率和氨基酸利用动力学上的差别；核黄素相关代谢物（FAD、FMN）丰度降低虽然黄粉虫本身富含核黄素，但可能涉及生物利用度或代谢利用差异，其生物学意义尚不明确。脾脏代谢组差异主要涉及脂质相关通路（甘油磷脂、亚油酸和类固醇相关代谢）以及核苷酸和氨基酸相关通路。由于脾脏并非胆汁酸合成的主要部位，胆汁酸相关代谢物的富集可能反映全身性暴露或代谢信号传导。组氨酸代谢相关代谢物在昆虫粉组丰度较低，可能与黄粉虫粉中组氨酸含量较低有关。

将肠道功能指标与器官代谢组学结果综合考虑，研究人员提出，昆虫基日粮诱导的肠道环境变化与肝脏和脾脏的代谢反应可能通过潜在的肠—肝—脾轴相互关联，但本研究并未确立器官间的因果通讯，通路富集也不应被解释为相应器官功能激活的证据。这些发现提示日粮相关差异在肠道功能标志物和外周器官代谢谱中同时存在，而非单个组织的孤立反应。

研究结论指出：含35%黄粉虫粉的日粮诱导了大鼠肠道微生物功能活性和宿主代谢的同步日粮相关差异。与对照组相比，昆虫基日粮改变了结肠发酵模式，表现为粪便短链脂肪酸浓度降低、β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性升高；与鸡水解物日粮组相比，黄粉虫组粪便水遗传毒性显著降低。非靶向代谢组学分析揭示肝脏和脾脏代谢物谱的日粮依赖性差异，主要涉及脂质、胆汁酸、核苷酸和氨基酸相关通路。这些发现为未来将代谢组学变化与生理和性能结果关联的研究奠定了基础。然而，丁酸产量的下降引发了对结肠健康的潜在担忧，值得进一步关注；由于本研究未直接评估肠道组织学和炎症反应，这些变化对肠道健康的生物学后果尚不明确。未来研究应探讨昆虫基日粮与抗性淀粉等膳食纤维的相互作用及其对肠道健康和全身代谢的长期影响。