《Journal of Xenobiotics》：Tri-Combination Antiretroviral Therapy Induces Dose- and Time-Dependent Disruption of Intestinal Epithelial Barrier Function and Repair Responses in Human T84 Cells
编辑推荐：
抗逆转录病毒疗法（ART）对于控制人类免疫缺陷病毒（HIV）感染至关重要，需要严格每日依从以实现终身病毒抑制。然而，这种持续口服给药导致胃肠道（GIT）持续暴露，因此有必要研究TC-ART（三联组合阿巴卡韦、多替拉韦、拉米夫定–ART）对上皮完整性、屏障恢复机
抗逆转录病毒疗法（ART）对于控制人类免疫缺陷病毒（HIV）感染至关重要，需要严格每日依从以实现终身病毒抑制。然而，这种持续口服给药导致胃肠道（GIT）持续暴露，因此有必要研究TC-ART（三联组合阿巴卡韦、多替拉韦、拉米夫定–ART）对上皮完整性、屏障恢复机制及表面屏障结构的影响。TC-ART暴露（125 μM至4000 μM）即使在亚细胞毒性剂量下也显示出跨上皮电阻、通透性和伤口愈合能力的显著改变。中剂量水平的暴露范围显示出最高的转录活性，其特征为连接基因[闭合蛋白（CLDNs）、桥粒芯蛋白（DSGs）和连接斑珠蛋白（JUP）]及信号介质[信号转导与转录激活因子3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶1和3（MAPK1/3）以及连环蛋白β1（CTNNB1）]的下调，同时伴有与黏蛋白丢失相关的IL-9表达降低。这些转录变化与结构发现一致，包括部分跨上皮电阻（TEER）恢复后下降、伤口闭合延迟以及顶端黏蛋白层呈剂量依赖性减弱。然而，若干细胞因子如IL-2和IL-6尽管转录水平较低，却显示出分泌增加，提示在早期应激反应中存在替代性调控机制。总之，这些结果支持TC-ART暴露改变上皮反应，其方式可能从早期适应转变为修复受损的迹象，导致黏膜屏障功能逐渐下降。这种浓度和时间依赖性的上皮应激可能有助于解释接受治疗的HIV人群中所观察到的胃肠道紊乱，并强调在药物安全性评价中纳入肠上皮健康终点的必要性。
论文解读：三联抗逆转录病毒疗法对肠上皮屏障功能与修复反应的剂量及时间依赖性破坏
一、研究背景与问题
肠上皮是营养吸收和离子调节的关键界面，同时充当微生物、饮食及药物暴露的动态屏障。肠上皮完整性破坏可增加通透性、触发炎症信号、改变黏蛋白层并损害伤口愈合反应，进而促进微生物易位、免疫激活及进行性组织损伤。三联抗逆转录病毒疗法（TC-ART）由核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）阿巴卡韦和拉米夫定以及整合酶链转移抑制剂（INSTI）多替拉韦组成，因其高效、便捷和良好的耐药谱而成为HIV患者的一线方案。尽管TC-ART的全身安全性已有充分记录，但其对胃肠上皮的潜在脱靶效应仍知之甚少。临床前毒理学研究显示，多替拉韦重复给药后胃肠道是主要靶器官。由于TC-ART主要在小肠吸收，肠上皮在管腔面和黏膜面均直接暴露于药物，反复暴露可能破坏上皮稳态。HIV感染者即使接受有效ART并实现病毒抑制，仍存在持续性上皮问题，包括通透性增加和微生物易位。此外，HIV感染者发生胃肠道并发症（黏膜损伤、溃疡、胃食管反流病和慢性免疫激活即“肠漏”）的风险持续较高。研究人员先前基于发育背景的体内研究显示，经母体孕期和哺乳期暴露于TC-ART的第二代大鼠子代出现肠道通透性、细胞因子谱、黏膜相关微生物群及粪便微生物丰度的性别特异性改变，提示即使最低程度的发育期暴露也可影响肠道功能。然而，TC-ART对肠上皮功能的直接毒理学效应仍不清楚。因此，本研究利用人结肠上皮细胞系T84，系统探究TC-ART在剂量和时间维度上对关键上皮功能的影响。
二、研究设计与技术方法
研究人员采用人结肠上皮T84细胞系（ATCC CCL-248?）作为体外模型。主要关键技术方法包括：（1）跨上皮电阻（TEER）实时监测，使用ECIS-TEER24系统连续记录TC-ART暴露后48小时内的屏障电阻变化；（2）96基因panel的RT2 Profiler PCR芯片分析，分别针对细胞连接通路（PAHS-213Z）和伤口愈合通路（PAHS-121Z），以β-肌动蛋白（ACTB）和β2-微球蛋白（B2M）为内参；（3）划痕伤口愈合实验结合活细胞成像，在14天内于第1、3、5、7、10、14天监测伤口闭合；（4）乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞毒性；（5）48重（48-plex）磁珠悬浮芯片技术检测细胞因子和趋化因子分泌；（6）高碘酸-雪夫（PAS）染色结合ImageJ/Fiji图像定量分析黏蛋白分布。TC-ART浓度范围为125–4000 μM（阿巴卡韦:拉米夫定:多替拉韦=12:6:1），依据FDA药物相互作用指南中约250 mL肠液体积估算的管腔上限浓度确定。研究还进行了时间动力学分析，在500 μM和1000 μM浓度下于1、3、6、12、24和30小时检测转录和细胞因子变化。
三、研究结果
3.1 TC-ART诱导早期上皮屏障改变并改变连接和炎症通路
TC-ART暴露导致TEER呈剂量和时间依赖性下降。超生理浓度（2000 μM和4000 μM）在2小时内即出现明显降低，24小时损失40–50%；1000 μM时TEER先下降后部分恢复；≤500 μM时TEER中度下降并稳定在基线的约70%。转录分析显示，125 μM和500 μM浓度下紧密连接基因（CLDN1、CLDN2、CLDN16）、桥粒和间隙连接基因（GJC2、DSC1、DSC3、DSG2、DST、ICAM2、JUP）显著下调；NECTIN1、NECTIN2和NOTCH1在各浓度均升高；促迁移整合素（ITGA1、ITGA5、ITGB6、ITGB4）升高，而结构组分DST和GJC2持续降低。细胞因子方面，125 μM触发早期促炎反应（IL-6和GRO/KC升高）；>1000 μM时修复相关细胞因子（VEGF和RANTES）降低，抗炎IP-10低浓度升高、高浓度降低，IL-7和IL-9在高浓度下降。
3.2 TC-ART改变肠上皮单层细胞的黏蛋白分泌和分布
PAS染色显示，TC-ART处理后黏蛋白强度和表面分布呈剂量依赖性减少。125 μM时即出现小而显著的降低；500 μM时黏蛋白显著减少，顶端表面出现变薄和斑片状分布；1000 μM时黏蛋白覆盖大面积丧失。定量分析证实黏蛋白阳性面积从125 μM起显著下降，500 μM和1000 μM进一步减少。
3.3 TC-ART以剂量依赖性方式减慢伤口闭合并改变修复相关基因表达
伤口愈合实验中，对照组在第7天完全闭合；250 μM在第10天闭合；500 μM和1000 μM在第10天仍不完全闭合且边缘不规则；2000 μM和4000 μM从第1天起即出现细胞死亡，单层在第10或14天几乎完全脱落。转录分析显示，500 μM和1000 μM时显著改变的基因数量最多。低浓度主要影响细胞黏附、ECM和生长因子相关基因；高浓度时炎症、蛋白酶和ECM通路广泛激活。2000 μM下大多数黏附基因（CDH1、ITGA1、ITGA5）明显下调，但ITGA4和ITGB3仍上调。关键增殖和血管生成调节因子（EGFR、PDGFA、VEGFA）在高浓度下调。
3.4 T84上皮单层细胞的时间依赖性转录和细胞因子反应显示短期TC-ART暴露损害伤口修复
在500 μM时间动力学研究中，整合素（ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGB3）在早期强烈诱导，凝血和纤溶基因（PLAU、PLAUR、SERPINE1、F13A1、FGG）上调，胶原基因COL1A2、COL3A1、COL4A1上调，而COL4A3、COL5A1、COL5A2、COL5A3下调。MMP1和MMP9上调，MMP7下调。细胞因子分泌呈现早期快速升高、24小时部分正常化的模式。在1000 μM时间动力学研究中，大多数基因在1小时即出现强烈下调，只有SERPINE1、CCL2、CCN2和MMP7接近基线；随时间推移，MMP1、SERPINE1和HBEGF呈轻度上升趋势，大多数整合素呈时间依赖性增加，而细胞骨架基因TAGLN和ACTA2持续下调。炎症细胞因子和趋化因子基因（IL1B、IL6、IL2、CXCL11、CSF2）在所有时间点均受抑制。IL-9转录下调与PAS染色观察到的黏蛋白破坏模式相吻合。
3.5 TC-ART在高浓度下诱导时间依赖性细胞毒性
LDH释放测定显示，2000 μM和4000 μM浓度在14天伤口愈合研究中于第5至10天出现最显著升高，第14天下降（归因于大量细胞丧失）。在1–30小时时间动力学实验中，两种浓度均在1至6小时出现早期LDH升高，随后在30小时再次升高。MoxiGo活力检测显示细胞活力随浓度和时间逐渐下降，4000 μM时活细胞显著减少。
四、讨论与结论
TC-ART暴露导致肠上皮屏障电阻、通透性、愈合能力和细胞因子谱的剂量和时间依赖性变化，且这些变化出现在亚细胞毒性浓度下，提示非细胞毒性水平的TC-ART也可损害上皮完整性。500 μM中剂量产生最多显著改变的基因，可能代表细胞在应激下维持屏障完整性的适应性转录调整；1000 μM时转录广泛抑制但无明显即刻细胞毒性，可能表明细胞在高应激条件下限制新基因表达。伤口愈合实验中，长时间暴露诱导重复应激和部分恢复循环，导致修复能力剂量依赖性受损。STAT3、MAPK1/3和CTNNB1的转录抑制可能反映多种修复通路受损，但通路激活不能仅从基因表达推断。细胞因子分泌中IL-2和IL-6转录下调而蛋白分泌增加，研究人员推测可能源于转录后调控机制，如转录本和蛋白稳定性差异、现有mRNA持续翻译、核糖体结合或预先翻译细胞因子的储存释放，但这些推测需后续研究验证。黏蛋白的剂量依赖性减少与IL-9降低一致，IL-9被报道调节MUC2表达和杯状细胞功能。黏蛋白丢失削弱物理屏障并使上皮更易受机械和微生物应激损伤。体内外研究结果的趋同支持肠上皮和黏膜减弱可能是慢性TC-ART暴露的内在后果，而非仅仅是HIV感染或免疫调节的继发效应。
结论：TC-ART对肠上皮功能产生广泛影响，包括结构、转录和分泌变化。即使在低于细胞毒性阈值的浓度下，TC-ART也干扰连接完整性、修复相关基因表达和黏蛋白分泌之间的协调。持续暴露可能造成累积性上皮应激，但长期生理后果无法仅从本研究确定。认识这些上皮脆弱性对于在终身治疗中将肠道健康视为药物安全性的独立决定因素至关重要。
