《Microorganisms》：Caries-Exclusive and Health-Associated Taxa in the Peruvian Pediatric Salivary Microbiome Identified by Full-Length Nanopore 16S Sequencing: Implications for Ecological Modulation of Dental Caries
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牙龋是秘鲁学龄儿童中最普遍的慢性非传染性疾病（患病率>70%）。全长度16S牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technology, ONT)测序可实现常规Illumina V3–V4平台无法达到的物种水平分辨率，这对解析口腔优势菌属链球菌属(S
牙龋是秘鲁学龄儿童中最普遍的慢性非传染性疾病（患病率>70%）。全长度16S牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technology, ONT)测序可实现常规Illumina V3–V4平台无法达到的物种水平分辨率，这对解析口腔优势菌属链球菌属(Streptococcus)属内多样性至关重要。本研究为一项横断面研究（遵循STROBE/STORMS标准），纳入来自秘鲁利马San Martín de Porres区IE N°3036 José Andrés Rázuri学校的30名8–10岁儿童（15名患龋，ceod/CPOD≥1；15名无龋，ceod/CPOD=0），龋态经ICDAS-II标准临床检查评估并以ceod/CPOD指数汇总。研究人员在MinION MK1B（MN40465）上采用全长度16S测序（约1500 bp；27F/1492R；SQK-16S024），两次运行中使用Flongle AUB828（运行1：21,651条PASS读长，Q=12.50；运行2：3750条PASS读长，Q=11.89）。分析流程为wf-16s v1.2.0（EPI2ME，NCBI 16S rRNA），统计采用Mann–Whitney U检验、Fisher精确检验（α=0.05）及PERMANOVA（999次置换）。共鉴定126个物种、63个属、5个门。唾液链球菌(S. salivarius)为优势种（22.5%；30/30）。26个物种仅见于龋组，以变异链球菌(S. mutans)（7/15，46.7%；OR=∞；原始p=0.006）和咽峡炎链球菌(S. anginosus)（4/15，26.7%；OR=∞；原始p=0.038）为主，另含小放线菌(Actinomyces naeslundii)等；15个物种仅见于健康组，包括气罗氏菌(Rothia aeria)、Gemella属sp.、Aggregatibacter kilianii及Bulleidia extructa。上述分类单元差异在126个物种Benjamini–Hochberg校正后均未存活（校正p>0.45），故作为探索性候选而非确证差异呈现。Alpha多样性（Shannon p=0.507）与全局Beta多样性（PERMANOVA p=0.215）无差异；但生态失调收敛显著（组内Bray–Curtis：0.322对0.414；p<0.001）。此为秘鲁儿童唾液微生物组首例ONT全长度16S表征，同时识别致龋与健康相关物种谱，提示膳食硝酸盐补充与木糖醇可作为候选益生元策略，值得未来干预研究以恢复无龋儿童健康相关分类单元。
研究背景方面，牙龋是全球最普遍的慢性非传染性疾病，秘鲁学龄儿童患病率超70%。传统短读长平台（Illumina V3–V4，约300 bp）难以分辨儿童口腔优势菌属链球菌属内物种，而牛津纳米孔技术(ONT)全长度16S（>1400 bp，V1–V9）可提升至物种水平，对区分S. mutans（致龋）与S. sanguinis（健康相关）及S. anginosus群（脓肿相关）至关重要。既往口腔微生物研究多只识别龋相关分类单元，未同步刻画健康相关分类单元，导致生态恢复干预无从设计。研究人员据此在秘鲁儿童中首次开展ONT全长度16S唾液微生物组研究，以同时获取致龋与健康相关物种谱，为生态调控提供依据。论文发表于《Microorganisms》。
主要关键技术方法方面，研究人员开展横断面分析，纳入利马San Martín de Porres区IE N°3036 José Andrés Rázuri学校30名8–10岁儿童（龋组15人ceod/CPOD≥1，健康组15人ceod/CPOD=0），龋态由ICDAS-II临床检查判定；采集非刺激性全唾液，提取DNA后以27F/1492R扩增约1500 bp 16S，用SQK-16S024建库，MinION MK1B加Flongle AUB828两次运行测序；生物信息学采用wf-16s v1.2.0比对NCBI 16S rRNA库，统计用Mann–Whitney U、Fisher精确检验及PERMANOVA（999置换），多重比较行Benjamini–Hochberg校正。
研究结果部分，3.1测序性能显示运行1获21651条PASS读长（Q=12.50），运行2因流细胞退化仅3750条（Q=11.89），合并25401条。3.2全局分类组成鉴定126种、63属、5门，厚壁菌门(Firmicutes)两组均主导，唾液链球菌占22.5%（30/30），副血链球菌(S. parasanguinis)与口腔链球菌(S. oralis)次之。3.3 Alpha与Beta多样性中Shannon H′龋组2.109±0.392对健康组1.985±0.450（p=0.507），PERMANOVA p=0.215，但龋组组内Bray–Curtis显著更低（0.322±0.128对0.414±0.158，p<0.001），证实生态失调收敛。3.4未校正分类差异中S. mutans原始p=0.004（Fisher p=0.006）、S. anginosus原始p=0.038、Veillonella dispar原始p=0.017，但FDR校正后均不显著。3.5组间专属分类单元分析获龋组专属26种（含S. mutans、S. anginosus、Lancefieldella parvula、Veillonella infantium、Actinomyces naeslundii），健康组专属15种（含Rothia aeria、Gemella sp.、Aggregatibacter kilianii、Bulleidia extructa），因每样本量小多仅1/15检出，作探索性候选。
讨论部分，研究人员指出厚壁菌门与链球菌属主导符合国际文献，唾液链球菌作为早期定植者产细菌素抑制酸源菌；生态失调收敛无Alpha多样性丢失，反映pH<5.5筛选及S. mutans产变链菌素(mutacins)形成正反馈。龋专属谱中S. anginosus为ONT全长分辨独有发现；健康谱中Rothia aeria近缘R. mucilaginosa产肠杆菌素拮抗S. mutans，Gemella属为健康口腔常驻，Aggregatibacter kilianii见于健康牙周，Bulleidia extructa为口腔黏膜共生菌；唾液矩阵虽较菌斑信号衰减，但适用于学童现场。策略上膳食硝酸盐（唾液腺浓缩至5–8 mM）5小时内升Neisseria与Rothia、降Veillonella与Streptococcus并升pH，木糖醇经无效磷酸循环选择性抑S. mutans，二者合入秘鲁MINSA/MINEDU学校项目具生态干预可行性。局限为n=30致OR≈15.7方达80%功效，缺提取空白与mock群落，29.9%读长未分类，Flongle二次用孔损78.9%。
结论部分翻译：本研究为秘鲁儿童（n=30）首例ONT全长度16S唾液微生物组表征，同步识别短读长不可见的致龋生态失调谱（26专属种）与口腔健康谱（15专属种）。S. anginosus（原始p=0.038）与S. mutans（原始p=0.004）为本探索分析龋专属候选分类单元，但126次比较校正后均无显著性。Rothia aeria、Gemella sp.、Aggregatibacter kilianii为健康相关候选分类单元，其于龋组缺失与致龋酸环境相关，此机制解释需直接验证而非已证因果。无Alpha多样性丢失的生态失调收敛（Bray–Curtis 0.322对0.414；p<0.001）确认局灶多微生物生态失调模型，系拉美儿童队列首次记录。上述候选健康分类单元与收敛模式支持膳食硝酸盐与木糖醇作为生物学可信、假设生成的益生元策略，其恢复保护菌功效应在未来无龋儿童干预试验中检验。
