《Catalysts》：Biocatalytic Production of Functional Oligosaccharides from Agricultural and Food Processing Residues: Toward Functional Oligosaccharide Production
编辑推荐：
农业和食品加工残留物是通过生物催化转化可持续生产功能性低聚糖的丰富可再生原料。将这些未被充分利用的生物质资源高值化，是生产高附加值生物活性低聚糖、同时提高资源利用效率并支持循环生物经济的一项有前景的策略。本综述探讨了利用农食残留物生物催化合成功能性低聚糖的最新
农业和食品加工残留物是通过生物催化转化可持续生产功能性低聚糖的丰富可再生原料。将这些未被充分利用的生物质资源高值化，是生产高附加值生物活性低聚糖、同时提高资源利用效率并支持循环生物经济的一项有前景的策略。本综述探讨了利用农食残留物生物催化合成功能性低聚糖的最新进展，重点介绍了针对特定残留物的生物催化技术和糖类活性酶 (CAZymes)。除了用于合成结构明确的低聚糖的新型转糖基化和基于合成酶的方法外，研究人员还对参与合成木寡糖、纤寡糖、果胶寡糖和壳寡糖的水解酶的催化机制和底物特异性进行了深入讨论。多酶级联系统、全细胞生物催化和固定化酶技术等生物催化平台的最新进展，被强调为提高催化效率、产物选择性和操作性能的有前景的策略，同时指出了酶工程和计算辅助生物催化剂开发的未来机遇。该综述为功能性低聚糖的可持续生产提供了以生物催化剂为中心的视角，并通过将特定残留物的生物质资源与当前的生物催化方法相联系，为未来工业生物炼制中开发有效的生物质高值化策略提供了见解。
1. Introduction
21世纪以来，非传染性慢性疾病（包括2型糖尿病、炎症性肠病、肥胖等）的患病率显著增加。饮食、生活方式和环境因素导致肠道微生物群失调，即肠道有益细菌多样性的失衡。因此，开发能够促进有益肠道微生物生长并恢复微生态平衡的营养策略至关重要。益生元作为有益的功能性食品成分备受关注，其被定义为宿主微生物优先利用以提供健康益处的底物。非消化性碳水化合物（如木寡糖 (XOS)、菊粉、果寡糖 (FOS) 和半乳寡糖 (GOS)）在上消化道逃逸消化，并被肠道微生物发酵产生短链脂肪酸，促进双歧杆菌和乳杆菌的生长。然而，并非所有的功能性低聚糖都能被归类为已确立的益生元，例如纤寡糖 (COS)、果胶寡糖 (POS) 和壳寡糖，其益生元效应需依据实验证据类型和水平进行严谨解读。
传统益生元生产主要依赖纯化碳水化合物，引发了对成本和可持续性的担忧。因此，农业、食品和海鲜加工残留物作为替代原料备受瞩目。农作物秸秆、谷物麸皮、果皮和虾蟹壳等废弃生物质富含纤维素、半纤维素、果胶、淀粉和几丁质，可用于生产 XOS、麦芽寡糖 和 ChOS。这些生物质目前多通过填埋或焚烧处理，导致温室气体排放和资源浪费。将其高值化转化为功能性低聚糖，不仅支持循环生物经济，还能解决废物管理挑战。尽管碳水化合物资源丰富，但复杂多糖的高效转化仍具挑战。传统的化学水解法存在底物选择性差、副产物多和设备腐蚀等缺陷。相比之下，生物催化法在温和条件下具有高催化效率和底物选择性，能更好地控制低聚糖的结构和聚合度 (DP)。广泛探索的糖类活性酶 包括用于生产 COS 的内切-β-1,4-葡聚糖酶、用于 XOS 的内切-木聚糖酶、用于 POS 的果胶酶以及用于 ChOS 的壳聚糖酶。本综述以生物催化剂为中心，重点探讨从富含多糖的残留物中生物催化生产 XOS、COS、POS、MalOS 和 ChOS 的机制与策略。
Literature-Search Methodology
研究人员利用 PubMed 和 Google Scholar 数据库检索相关文献，检索词涵盖生物质原料、低聚糖和生物催化方法等。文献筛选强调近期同行评审研究，同时纳入提供酶机制或基本生物催化概念的基础研究。排除了与低聚糖生产无关或仅依赖化学转化的研究。
2. Agricultural and Food Processing Residues as Carbohydrate Reservoirs
全球农业和食品加工行业的高速增长导致大量有机废弃物积累。据联合国粮农组织估计，全球约三分之一的粮食被损失或浪费，导致富含碳水化合物的生物质大量堆积。这些副产物通常采用填埋处理，产生大量二氧化碳当量 (CO
2e)，被视为最不可持续的处理方式。然而，通过循环生物经济原则，这些副产物可转化为可再生原料。农食残留物具有复杂的纤维素、半纤维素、果胶、淀粉、几丁质和木质素等基质结构。这种成分异质性为利用生物催化技术合成结构独特的低聚糖提供了广泛的碳水化合物底物。
例如，谷物加工残留物富含阿拉伯木聚糖，可通过木聚糖酶作用生产 XOS 和阿拉伯木聚糖寡糖 (AXOS)；果皮和苹果渣中的果胶多糖可转化为 POS；海鲜加工残留物中的几丁质可被降解为具有生物活性的 ChOS。残留物的可获得性和地理分布对工业可行性至关重要。由于气候、土壤和加工技术的影响，生物质的结构特性和成分存在变异，导致酶可及性和水解效率发生变化，进而增加了工艺标准化和工业放大的难度。此外，木质纤维素中包裹纤维素微原纤维的半纤维素-木质素基质、纤维素的结晶结构以及果胶的复杂结构，构成了显著的生物催化转化瓶颈。因此，需要采用物理、水热、稀酸、碱或生物等预处理技术，在破坏生物质顽抗性的同时保留目标多糖的结构完整性，从而最大化碳水化合物活性酶的可及性。
3. Biocatalysts for Functional Oligosaccharide Synthesis
生物催化方法能够提供更高的区域选择性和立体选择性，减少副产物形成，并更好地控制低聚糖的聚合度 (DP)。酶的发现、蛋白质工程和多酶级联设计等技术显著扩展了低聚糖生产的催化工具箱。
3.1. Hydrolytic Enzyme Systems
控制性酶水解是生产功能性低聚糖最广泛使用的生物催化技术。糖苷水解酶 是最大的 CAZymes 类别，通过保留或翻转催化机制选择性切割多糖中的糖苷键。根据作用方式，可分为内切酶和外切酶。外切酶从多糖链末端切除糖单元，而内切酶切割聚合物主链内的糖苷键，产生较宽 DP 分布的低聚糖。
在各种水解系统中，内切-木聚糖酶（主要属于 GH10 和 GH11 家族）被广泛用于从半纤维素残留物中生产 XOS。GH10 木聚糖酶具有开放的底物结合裂隙，对取代基耐受性较高；而 GH11 木聚糖酶结合裂隙较窄，通常需要三个连续未取代的木糖残基才能切割。纤寡糖 (COS) 的生产依赖于纤维素酶系统（主要涉及 GH5、GH6、GH7、GH9 和 GH48 家族）的协同作用。内切葡聚糖酶水解内部的 β-1,4-糖苷键，纤维二糖水解酶从末端释放纤维二糖，而 β-葡糖苷酶进一步将其水解为葡萄糖。此外，裂解多糖单加氧酶 通过铜依赖机制在结晶纤维素中引入氧化切割，为纤维素酶提供新起点。淀粉降解酶（主要属于 GH13 家族）水解 α-1,4-糖苷键生产 MalOS。几丁质酶和壳聚糖酶（主要涉及 GH18、GH19、GH46、GH75 等）将几丁质和壳聚糖解聚为 ChOS。果胶酶（如多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶）通过协同作用降解果胶。果胶裂解酶偏好高甲酯化果胶，而果胶酸盐裂解酶对低甲酯化底物活性更高。GH28 家族的内切多聚半乳糖醛酸酶具有包含 NTD、DD、GHG 和 RIK 保守片段的隧道状活性位点。
酶的结构特征（如底物结合裂隙和活性位点几何形状）决定了切割特异性和产物组成。复杂多糖的转化通常需要酶混合物的协同作用。然而，过度优化酶混合物可能导致目标低聚糖进一步降解为单糖。因此，必须仔细优化酶组成和反应条件，以平衡底物解聚与有限的二次水解。低聚糖的 DP、取代模式和乙酰化模式等结构特征会影响其随后的微生物利用和生物学功能。
3.2. Transglycosylation and Glycosynthase-Based Approaches
传统水解通常产生异质混合物，而转糖基化利用保留型糖苷水解酶的双置换机制形成临时共价糖基-酶中间体，将其转移至糖或醇受体形成新的糖苷键。这允许在无需昂贵激活糖供体的情况下一步合成低聚糖。然而，产物水解常降低产率。通过增加底物浓度、降低水分活性和蛋白质工程可调节平衡。例如，具有持续性的 GH18 内切几丁质酶表现出高转糖基化活性，可从短链底物合成长链 ChOS（DP 高达 13）。
糖苷合成酶是一类工程化的保留型糖苷酶，其催化亲核试剂（通常是谷氨酸或天冬氨酸）被非亲核氨基酸（如丙氨酸或甘氨酸）取代。这种修饰消除了水解活性但保留了糖基转移能力，利用激活的 α-糖基氟化物供体，实现了具有优异区域和立体选择性的结构明确低聚糖的高产合成。由于消除了催化亲核试剂，产物水解显著减少。尽管糖苷合成酶在精确合成结构明确的聚糖方面表现出色，但其在复杂农食残留物中的直接应用仍受限。将水解转化与糖苷合成酶介导的合成相结合，代表了将残留物衍生碳水化合物转化为高价值低聚糖的未来方向。此外，计算蛋白质设计、定向进化和人工智能正在加速具有增强催化效率的 CAZymes 的发现与优化。
4. Advanced Biocatalytic Platforms for Oligosaccharide Production
多酶级联生物催化将多个催化过程整合在单一反应器中，减少了中间体纯化步骤，并通过连续去除中间体来移动反应平衡，减少产物抑制并提高整体转化率。例如，内切-木聚糖酶与呋喃阿拉伯糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶协同作用，可提高 XOS 产率。内切葡聚糖酶、LPMOs 和纤维二糖脱氢酶协同作用可从甘蔗渣生产 COS。果胶酶混合物可从果皮中高效生产 POS。在 ChOS 生产中，研究人员利用具有协同几丁质裂解酶和 LPMO 的微生物菌群，实现了从虾壳粉直接生产高聚合度 (DP > 10) 的 ChOS。
全细胞生物催化通过在活微生物细胞内整合催化转化、辅因子再生和酶合成，消除了酶纯化步骤，提高了酶稳定性。通过在宿主中共同表达多种酶，全细胞系统特别适合多步级联反应。目前该技术已成功用于纤维糊精和特制寡糖的合成，但其对复杂农食残留物的直接转化仍处于起步阶段，需要更好的底物可及性和细胞耐受性。
5. Immobilized Biocatalytic Systems for Oligosaccharide Production
游离酶在工业应用中常受限于操作稳定性差和难以回收。酶固定化技术将酶固定在不溶性载体上，显著提高了其抗变性能力、pH 和热稳定性，并允许在多个反应周期中重复使用。固定化策略包括物理吸附、共价偶联、包埋和无载体固定化（如交联酶聚集体 CLEAs）。合理的固定化设计直接影响底物可及性和催化效率。
固定化碳水化合物活性酶在提高可重复使用性和操作稳定性方面显示出巨大潜力。例如，共价偶联在酰胺化果胶-聚乙烯亚胺-戊二醛载体上的木聚糖酶，可重复使用 20 个循环，从农业残留物中生产 XOS。固定化在氧化纳米纤维素上的内切木聚糖酶和交联突变木聚糖酶聚集体也有效生产了 XOS。在 POS 生产中，包埋在溶胶-凝胶中的多聚半乳糖醛酸酶用于芒果皮水解，固定在功能化二氧化硅上的果胶酶用于柑橘果胶。固定在海藻酸钠 (SA) 上的内切多聚半乳糖醛酸酶将橙皮果胶转化为具有益生元潜力的 POS。对于 ChOS，固定在磁性纳米颗粒和壳聚糖珠上的外切几丁质酶 Chit42 用于虾壳残留物的水解，提高了热稳定性和水解活性。固定在磁性纳米载体上的几丁质酶在 16 个反应循环后仍保持一定活性，并成功从虾壳和鱿鱼须中生产了二-N-乙酰壳二糖。
生物催化转化后需进行下游处理以获得所需纯度的低聚糖。膜分离技术如超滤 (UF) 和纳滤 (NF) 可有效富集低聚糖并去除杂质。色谱方法（如 HPAEC-PAD）可用于表征回收的低聚糖馏分并建立产物谱图。低聚糖的 DP 分布和结构特征影响其功能特性，因此必须将生物催化性能与生物学验证相结合进行评估。
6. Conclusions and Future Outlook
农业和食品加工残留物是生产高价值生物活性成分的丰富可再生资源。在循环生物经济框架下，酶介导的生物质高值化因其在底物选择性、区域和立体选择性以及温和反应条件方面的显著优势，成为最具前景的策略之一。CAZymes 的发展扩大了催化工具的范围。尽管转糖基化和糖苷合成酶方法实现了结构明确的低聚糖合成，但水解酶（如木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和壳聚糖酶）仍是残留物特异性低聚糖生产的基础。多酶级联和固定化系统等先进平台提高了催化效率和操作性能。全细胞生物催化和糖苷合成酶的应用虽然前景广阔，但在复杂农食残留物中的直接应用仍需进一步发展。
当前，残留物的内在结构复杂性和成分异质性常降低酶可及性和转化效率。精确控制 DP、糖苷键模式和产物组成仍面临挑战。为推进工业规模应用，需要在酶稳定性、催化剂可回收性、产物回收和生物过程整合方面取得进展。未来研究应侧重于发现和工程化高效 CAZymes，开发整合生物质预处理、酶转化、下游分离和产物表征的框架。重要的是，必须结合技术经济学分析和生命周期评估以衡量整体可持续性。此外，机器学习、蛋白质语言模型和 AlphaFold 等结构预测工具的计算方法正越来越多地应用于酶的发现和工程化，这将加速针对残留物特异性低聚糖生产的生物催化剂开发，支持未来生物炼制中从废物管理向高附加值生物制造的转变。
