Streptomyces hydrogenans EM-F5 中的好氧异化硝酸盐还原为铵：代谢见解、生理活性及驱动因素

《Applied and Environmental Microbiology》：Aerobic dissimilatory nitrate reduction to ammonium in Streptomyces hydrogenans EM-F5: metabolic insights, physiological activity, and driving factors

　　

异化硝酸盐还原为铵（DNRA）可在土壤中保留氮并减少温室气体排放。然而，细菌厌氧DNRA存在一定缺陷，如需要严格厌氧条件、管理复杂且成本高昂。研究人员分离到一株新的放线菌菌株EM-F5，并鉴定为*Streptomyces hydrogenans*。菌株EM-F5表现出广泛的环境适应性（pH 6.20–9.20，接种量0.10–0.50 × 10⁸ CFU/mL，溶解氧3.30–7.25 mg/L，温度18℃–38℃）。以淀粉为碳源时，菌株EM-F5通过好氧DNRA实现了98.04%的硝酸盐还原率和54.89%的铵生产效率，而在厌氧条件下仅转化37.35%的硝酸盐。电子传递系统活性（ETSA）、三磷酸腺苷（ATP）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH/NAD⁺）分别达到0.11 μg O₂ g^?1 min^?1、29.73 μmol/g和5.24，证实了好氧DNRA的高效性。硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NIR）的比活性分别为0.323和0.018 U/mg蛋白，证实其在该DNRA途径中的关键催化功能。氮平衡（氮损失25.46%）实验进一步证实菌株EM-F5的好氧DNRA途径为NO₃^?-N→NO₂^?-N→NH₄⁺-N。这些发现扩展了当前对放线菌中DNRA的认识，并为土壤中的氮循环提供了有前景的微生物资源。

论文解读：好氧DNRA放线菌*Streptomyces hydrogenans* EM-F5的代谢、生理活性及驱动因子

氮是生物体必需营养元素，土壤是作物获取氮的主要来源。然而，全球人口增长导致粮食需求激增，自然固氮不足以支持农业生产，约半数粮食供应依赖工业氮肥。过量施肥使土壤中盈余氮转化为硝酸盐，进而可通过反硝化或异化硝酸盐还原为铵（DNRA）等生物过程去除。反硝化将硝酸盐永久转化为氮气（N₂），会造成氮损失并增加温室气体排放风险；而DNRA将硝酸盐还原为铵，有利于氮保留和回收利用。传统观点认为DNRA仅由厌氧或限氧环境中的细菌完成，例如*Desulfovibrio* sp. CMX在72小时厌氧培养中可将0.345 g/L硝酸盐转化为0.207 g/L铵，效率约60%；*Desulfovibrio vulgaris* AL-1等在21天内将32.7%–46%的硝酸盐（100 mg/L）转化为铵。但厌氧DNRA管理复杂、成本高。虽已有好氧条件下DNRA的报道，但普遍转化不完全或效率极低，如*Pseudomonas putida* Y-9在好氧下虽去除88.47%硝酸盐，但仅产生3.42 mg/L铵。因此，寻找能在好氧条件下高效进行DNRA的微生物资源具有重要意义。放线菌在堆肥、湿地和南极等环境中是DNRA的主要菌属，且能在高温堆肥条件下进行DNRA，并具有高效产铵而不积累有害中间产物的潜力。然而，关于*Streptomyces hydrogenans*是否具备DNRA能力尚未见报道。本研究从中国贵州草海湿地分离到一株新的放线菌EM-F5，经形态学和16S rRNA基因测序鉴定为*Streptomyces hydrogenans*，系统研究了其好氧与厌氧条件下的DNRA特性、环境因子影响、生理活性及关键酶活性，论文发表在《Applied and Environmental Microbiology》。

研究人员采用的关键技术方法包括（不超过250字）：菌株分离自中国贵州草海湿地土壤，通过富集培养、形态学观察和16S rRNA基因测序鉴定；在好氧和厌氧条件下以淀粉为碳源比较DNRA活性；采用单因子实验评估温度、pH、溶解氧、接种量以及S^2?/NO₃^?、Fe²⁺/NO₃^?、NO₂^?/NO₃^?比例对DNRA的影响；测定电子传递系统活性（ETSA）、三磷酸腺苷（ATP）、NADH/NAD⁺水平；测定硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NIR）比活性；通过氮平衡实验分析氮素转化路径。

研究结果如下：

**菌株形态与分子鉴定**：通过高硝酸盐转化效率和铵积累为筛选标准，从草海湿地土壤中分离出目标菌株EM-F5。该菌落呈白色、圆形、边缘规则、表面干燥呈白粉状、不透明，革兰氏染色阳性，扫描电镜显示为长丝状杆，符合放线菌特征。16S rRNA基因序列与*Streptomyces hydrogenans* JCM 4771相似性最高（99.72%），邻接法系统发育树也表明其与*Streptomyces hydrogenans*亲缘关系最近。

**菌株EM-F5在好氧和厌氧条件下DNRA活性的差异**：好氧条件下，以淀粉为碳源时，48小时内硝酸盐几乎完全转化（99.86%），144小时铵积累量达到峰值，占还原硝酸盐的54.89%，全程未检出亚硝酸盐。氮平衡实验显示，144小时后铵产生量为44.43 mg/L，剩余硝酸盐5.11 mg/L，无亚硝酸盐，胞内氮为26.52 mg/L，氮损失仅25.46%，说明大部分硝酸盐转化为铵和胞内氮，证实为好氧DNRA。厌氧条件下，240小时内硝酸盐浓度从102.90 mg/L降至64.47 mg/L，转化率仅37.35%，亚硝酸盐从0.62 mg/L升至40.32 mg/L，而铵积累仅0.51 mg/L；氮平衡显示亚硝酸盐积累22.99 mg/L，铵仅2.34 mg/L，氮损失为0，NIR比活性仅0.004 U/mg protein，表明菌株EM-F5在厌氧条件下不能完成DNRA，仅能将部分硝酸盐转化为亚硝酸盐。

**环境因子对菌株EM-F5 DNRA能力的影响**：溶解氧实验中，DO为3.30–7.25 mg/L时硝酸盐转化效率均在96%以上，DO为7.25 mg/L时铵积累最高（52.37 mg/L，效率51.80%），而DO为2.39 mg/L时无DNRA能力，表明该菌株好氧DNRA对氧不敏感且在高氧下更强。温度实验中，18–38℃范围内硝酸盐转化效率均高于96%，铵积累随温度升高从28.05 mg/L升至53.85 mg/L（效率56.70%），说明温度升高有利于DNRA。pH实验中，pH 7.20时铵积累最高（55.13 mg/L），在pH 6.20–9.20范围内均具DNRA活性，而pH 5.20时几乎无活性。接种量实验中，0.10–0.50 × 10⁸ CFU/mL范围内硝酸盐转化效率均大于98%，最适接种量为0.30 × 10⁸ CFU/mL，铵积累达58.96 mg/L。S^2?/NO₃^?实验中，S^2?的添加抑制硝酸盐转化，浓度越高抑制越强；低比例初期抑制，后期可恢复，高比例持续抑制。Fe²⁺/NO₃^?实验中，Fe²⁺总体抑制DNRA，当比例≥6时无铵产生，推测低比例有利于DNRA，高比例转向反硝化。NO₂^?/NO₃^?实验中，当比例>1/4时菌株无DNRA能力；在低比例（1/8和1/16）下铵积累分别为11.89和35.88 mg/L。在总氮不变、不同NO₃^?/NO₂^?比例混合氮源条件下，336小时后各比例均产生较高铵（39.55–45.73 mg/L），且随硝酸盐比例升高铵产量增加，表明菌株EM-F5优先利用硝酸盐进行DNRA。

**菌株EM-F5好氧DNRA过程中的生理活性分析**：ETSA在96小时达到峰值0.1134 μg O₂ g^?1 min^?1，并在96–240小时维持较高水平，保证电子高效传递。ATP浓度从48小时的3.84 μmol/g升至144小时的29.73 μmol/g，与铵产量显著正相关，表明高能量状态驱动DNRA。NADH/NAD⁺比值在96小时达到最高5.24，并在96–192小时维持在4.71–5.24之间，为硝酸盐还原提供充足还原力。这些生理指标共同证实菌株EM-F5通过协调电子传递、能量代谢和氧化还原平衡实现高效好氧DNRA。

**好氧DNRA相关酶活性分析**：NR比活性为0.323 U/mg protein，显著高于已报道的*P. putida* NP5和*Paracoccus denitrificans* ISTOD1（0.02 U/mg protein）；NIR比活性为0.018 U/mg protein，与*Klebsiella pneumoniae* CF-S9（0.02 U/mg protein）和*Diaphorobacter* sp. PD-7（0.019 U/mg protein）相近，但略低于*Streptomyces mediolani* EM-B2（0.024 U/mg protein）。酶活性检测证明NR和NIR存在于菌株EM-F5中并催化DNRA代谢过程。

总结讨论部分：研究人员指出，菌株EM-F5在好氧条件下高效完成DNRA，与多数仅能在厌氧条件下进行DNRA的细菌不同。其高氧环境下的DNRA能力强于低氧，可能与独特的氧调控机制有关。温度升高可增强代谢活性从而促进DNRA；中性或微碱性pH有利于NrfA型DNRA。硫化物和铁离子的抑制作用与部分报道相反，可能归因于菌株调控基因的差异。在NO₂^?与NO₃^?共存时，菌株优先利用硝酸盐，且氮素总量增加有利于DNRA。这些发现拓展了放线菌好氧DNRA的认识，为硝酸盐污染土壤的生物修复提供了优良菌源。

研究结论：新型放线菌*Streptomyces hydrogenans* EM-F5分离自草海湿地，扩展了好氧DNRA菌株库。好氧条件下该菌基本完成硝酸盐还原，铵生产效率占转化硝酸盐的54.89%；厌氧条件下仅转化37.35%硝酸盐，部分转化为亚硝酸盐而非完全DNRA。此外，菌株EM-F5能在广泛环境条件下高效进行DNRA，且相比亚硝酸盐更倾向于利用硝酸盐。酶比活性、氮平衡和生理活性指标的测定进一步证明了其好氧DNRA的高效性。该研究为通过DNRA提高铵产量提供了基础数据，并为农业土壤的氮保留与循环提供了有前景的候选菌株。