《Environments》：Non-Target Profiling of the Wastewater Metabolome Using a Suite of HRMS Tools: A Study Across Diverse Treatment Plants
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废水分析已成为基于废水流行病学、环境监测和新兴污染物监控的有力工具。尽管多数研究依赖于针对预定义化合物列表的靶向方法，非靶向代谢组学仍有望提供更广泛、更少偏倚的化学快照。然而，废水基质的复杂性和小分子的化学多样性带来了分析挑战。在本研究中，研究人员应用多平台非
废水分析已成为基于废水流行病学、环境监测和新兴污染物监控的有力工具。尽管多数研究依赖于针对预定义化合物列表的靶向方法，非靶向代谢组学仍有望提供更广泛、更少偏倚的化学快照。然而，废水基质的复杂性和小分子的化学多样性带来了分析挑战。在本研究中，研究人员应用多平台非靶向代谢组学工作流程，对西班牙五座污水处理厂的进水废水代谢组进行轮廓分析，这些处理厂在地理背景、人口规模和工业活动方面存在差异。在三个季节采集了24小时混合样品，并采用气相色谱、反相液相色谱和亲水相互作用液相色谱（均与质谱联用）进行分析。跨平台共注释出828种独特化合物，重叠极少，凸显了分析方法和萃取策略的互补性。多变量分析揭示了与地点相关的可重复化学模式，这些模式在不同季节和平台间保持一致。主要贡献物质包括脂质、有机酸、有机氧化合物、有机杂环化合物和苯环型化合物，反映了人口和人类活动的差异。本研究证明了多平台非靶向工作流程用于生成废水进水互补且可重复的比较性轮廓的可行性。所得公共数据集旨在作为方法学和探索性比较资源，在进行推广或用于来源归因之前，需开展更广泛的空间和时间纵向验证。
**论文解读：基于多平台高分辨质谱的非靶向废水代谢组学分析——跨处理厂比较研究**
**1. 研究背景与问题**
废水含有来自人体排泄物、家庭用品、食物消费、工业活动和环境输入的小分子复杂混合物。废水分析作为基于废水流行病学、环境监测和新兴污染物检测的工具日益受到关注。然而，传统废水研究多采用靶向分析方法，针对特定化合物类别（如药物、非法药物、农药、工业化学品），虽具有高灵敏度和定量准确性，但局限于预定义化合物列表，可能遗漏未知或未被识别的成分。非靶向代谢组学通过高分辨质谱（HRMS）和多种色谱分离技术，可进行广泛、无假设的小分子检测。然而，废水基质化学组成极端复杂、浓度范围宽、参考标准品有限，化合物鉴定和解释困难。单一平台只能覆盖部分化学空间，多平台联用可提高覆盖率和稳健性，但系统性地将气相色谱-质谱（GC-MS）、反相液相色谱-质谱（RPLC-MS）和亲水相互作用液相色谱-质谱（HILIC-MS）应用于同一批废水进水样品并进行跨平台综合比较的研究仍有限。本研究旨在评估多平台非靶向代谢组学方法能否产生可重复的、与地点相关的废水进水化学指纹，而非进行详尽的代谢物鉴定或明确的来源归因。
**2. 研究内容与结论**
研究人员从西班牙加泰罗尼亚巴塞罗那省和赫罗纳省的五座污水处理厂（WWTPs）采集24小时混合进水样品，涵盖冬季、春季和夏季三个季节。处理厂在人口规模和工业影响上存在差异，如Besòs服务约150万人口且工业影响较小，而Banyoles和Vic居民人口较少但工业贡献较强。样品经离心、过滤、冻干、复溶，采用改良的甲基叔丁基醚（MTBE）萃取方案分为有机相和水相。有机相用于RPLC-MS分析，水相用于GC-MS和HILIC-MS分析。质谱数据在数据依赖性采集（DDA）模式下获取，GC-MS使用电子电离（EI），RPLC-MS和HILIC-MS采用正负电喷雾电离（ESI）。化合物鉴定通过MS-DIAL软件处理，比对公共谱库（MoNA、NIST20）及Fiehn实验室的m/z-RT库，并按照代谢组学标准倡议（MSI）置信度水平进行人工核查。数据经对数转换、分位数归一化后，使用limma包进行差异丰度分析（DAA），以|FC|>1.5和调整后p值<0.05为阈值。主成分分析（PCA）和层次聚类分析用于探索样品分布和站点模式。
研究共注释出828种独特化合物，RPLC-MS检出142种，GC-MS检出254种，HILIC-MS检出498种。平台间重叠极少：RPLC-MS与GC-MS共享6种，RPLC-MS与HILIC-MS共享2种，GC-MS与HILIC-MS共享55种，无化合物被三种平台共同检出，突显了平台的高度互补性。PCA显示GC-MS和HILIC-MS数据中样品按采样地点聚类，去除季节变异性后地点分离更明显；RPLC-MS则呈现不同的分布模式。差异丰度分析结合层次聚类识别出每个平台6个主要聚类，Besòs和Vic始终是最具差异性的两个地点，各具有特定的上调代谢物簇。化学分类表明，RPLC-MS以脂质为主（约92%），GC-MS以有机氧化合物（27%）和有机酸及衍生物（26%）为主，HILIC-MS以有机酸及衍生物（约45%）为主。跨平台比较显示，对地点差异贡献最大的五类物质为脂质、有机酸、有机氧化合物、有机杂环化合物和苯环型化合物。值得注意的是，长链脂肪酸（13-21个碳）在所有处理厂均有检出，而超长链脂肪酸（≥22个碳）在服务人口较多的Besòs、Girona和Olot中特别丰富。有机杂环化合物（如尼古丁代谢物、咖啡因、茶碱、尿酸、吲哚衍生物等）几乎在所有地点检出，但在Vic和Banyoles中丰度较低。苯环型化合物主要在Besòs、Girona和Olot中检出，在Banyoles和Vic中稀少。这些模式与人口规模和工业活动相关，但研究人员强调应视为探索性经验指纹，而非确定性来源证据。
**3. 主要技术方法**
研究采用的关键技术方法包括：多平台色谱-质谱联用分析（GC-MS、RPLC-MS、HILIC-MS，均配备高分辨质谱仪）；基于MTBE的液-液萃取方案，将样品分为有机相和水相分别分析；数据依赖性采集（DDA）模式获取MS/MS谱图；利用MS-DIAL软件进行特征检测、比对和注释，结合MoNA、NIST20公共谱库及Fiehn实验室的m/z-RT库；MS-Flo用于去除同位素峰、重复特征和加合物；ClassyFire或Ref-Met进行化学分类；使用limma包进行差异丰度分析（DAA），并通过层次聚类和PCA进行多变量统计分析。样品来源为西班牙加泰罗尼亚五座WWTPs的24小时混合进水，每地每季一份样品，共15个样品，每个样品设有技术重复。
**4. 结果分述**
**4.1 化合物注释结果**：MS-DIAL初始检测到大量特征（如RPLC-MS正离子模式23824个特征），经人工核查和MSI分级后，最终保留828种独特化合物。平台间重叠有限，证实多平台策略的必要性。
**4.2 化合物分类结果**：RPLC-MS主要富集脂质（脂肪酸酰基40%、鞘脂31%、甘油酯18%等），GC-MS检出多种有机氧化合物和有机酸，HILIC-MS检出有机酸及衍生物占主导（45%），并发现GC-MS和RPLC-MS未检出的生物碱、木脂素和有机硫化合物。
**4.3 主成分分析结果**：GC-MS和HILIC-MS数据中，同地点三个季节的样品倾向于聚在一起，去除季节变异后地点分离更清晰。RPLC-MS则显示Besòs和Girona形成独立群体，Banyoles、Olot和Vic聚集。不同平台聚类模式差异反映了各自的化学选择性。
**4.4 差异丰度和层次聚类分析结果**：显著差异代谢物数量为RPLC-MS 122种、GC-MS 241种、HILIC-MS 485种。聚类分析显示Besòs和Vic是差异最大的地点，且Vic的第三个采样季与Banyoles聚类更接近（在GC-MS和HILIC-MS数据中），提示可能存在时间相关变化。跨平台分析显示差异代谢物主要属于脂质、有机酸、有机氧化合物、有机杂环化合物和苯环型化合物，但各平台贡献不同。
**5. 讨论与结论**
研究人员讨论了废水代谢组的复杂性，指出代谢物来源多样，包括人体体液（尿液、粪便、血液）、家庭化学品、药品、食物残渣和工业排放。由于未获取详细的工业排放和集水区数据，代谢物分配只能基于化学结构和已知用途推断。研究识别出几个值得关注的化合物类别：氨基酸在所有样品中检出，与先前蛋白质组学分析发现的可溶性蛋白一致；单糖（属于有机氧化合物）由GC-MS主要检出，与食物残渣和人体代谢相关；脂质中，超长链脂肪酸在人口密集的处理厂中富集，提示可能主要来源于人体；有机杂环化合物中，尼古丁代谢物（2-羟基烟酸、3-反式羟基降烟碱等）、咖啡因、茶碱、尿酸、吲哚衍生物（如吲哚-3-乙酸、褪黑素）以及药物阿托伐他汀等被鉴定；苯环型化合物包括多种药物（5-氨基水杨酸、曲美布汀、氨磺必利、比芬美兰、氯沙坦、替米沙坦、文拉法辛等），但分布不均匀。研究结论指出，多平台联合工作流程显著提高了化合物覆盖率，验证了平台互补性，并证明在现有采样设计下可生成可重复的比较性轮廓。然而，该数据集应视为探索性资源，不能作为通用参考废水代谢组。推广前需在更多区域、处理厂、水文条件和纵向采样中验证。研究的主要方法学成就是展示了GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS的联合使用如何拓宽化学空间覆盖，并为未来的靶向和可疑筛查研究提供优先候选标记物。
**6. 研究结论翻译**
本研究对五座污水处理厂在三个季节采集的进水样品应用了三种互补的基于质谱的平台。联合工作流程相对于任何单一平台显著提高了化合物覆盖率，GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS之间的有限重叠证明了其正交选择性。在此数据集内，技术重复可重复，且在校正季节相关变异性后，观察到与地点相关的模式。因此，本研究实现了其主要方法论目标，即证明平台互补性并评估比较性非靶向分析的可行性。在进行常规来源归因或操作监测之前，需要更长时间的纵向采样、外部验证、更丰富的集水区元数据以及候选标记物的靶向确认。公共数据集应被视为探索性比较资源和优先进行未来靶向及可疑筛查研究的基础。废水代谢组的捕获比例未知，但可通过额外的萃取策略和分析平台加以扩展。主要鉴定出的化合物类别包括有机氧化合物、有机酸、有机杂环化合物、苯环型化合物和脂质。尽管许多化合物的确切来源难以确定，但可推断出一些可能的来源，例如氨基酸和二肽可能来源于废水中的可溶性蛋白，而食物废物可能贡献了单糖。尽管存在这些不确定性，在不同人口规模和工业活动的站点间观察到不同的化学轮廓。超长链脂肪酸酰基、有机杂环化合物和苯环型化合物在人口压力较大的站点中更为普遍。总体而言，本研究提供了一个公共探索性数据集，并证明GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS的组合使用能显著拓宽化学覆盖范围，并能在现有采样设计内生成可重复的比较性轮廓。该数据集不应被视为通用的参考废水代谢组。在更广泛的推广或操作应用之前，需要在更多区域、处理厂、水文条件和纵向采样活动中进行验证。
