凝血因子XII缺乏减轻脑β-淀粉样变性和脑淀粉样血管病小鼠模型中的血管功能障碍和认知损伤

《Aging Brain》：Coagulation factor XII deficiency alleviates vascular dysfunction and cognitive impairment in a mouse model of cerebral β-amyloidosis and cerebral amyloid angiopathy

　　

淀粉样蛋白-β（Aβ）可激活因子XII（FXII）驱动的接触系统，该系统对与认知损伤相关的阿尔茨海默病（AD）病理产生多种下游效应。本研究利用基因修饰的FXII缺陷小鼠与arcAβ小鼠杂交，研究人员证明FXII的基因缺失可改善β-淀粉样变性介导的动脉血栓形成易感性、血脑屏障渗漏和脑微出血负荷。此外，研究人员证明FXII基因缺失可改善认知缺陷，且不影响Aβ沉积。因此，FXII驱动的接触系统构成了AD中血管功能障碍和认知损伤的重要通路，且独立于Aβ神经病理学，对该疾病的诊断和治疗具有重要意义。

**论文解读：凝血因子XII缺乏对脑β-淀粉样变性和脑淀粉样血管病小鼠模型血管功能与认知损伤的改善作用**

**研究背景与目的**

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）以错误折叠的淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）和tau蛋白沉积为特征，导致神经退行性变和认知障碍。除神经病理学改变外，临床和实验研究均证实AD中存在血管功能障碍，表现为脑血流调节受损、血管形态和密度改变、血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）完整性破坏以及Aβ清除减少。此外，AD与脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy, CAA）存在高度重叠，CAA可加重血管功能障碍，使AD合并脑血管疾病的患者易发生血管并发症。

凝血系统异常在AD患者及动物模型中已被证实。凝血因子XII（coagulation factor XII, FXII），又称哈格曼因子，在AD患者血浆及脑β-淀粉样变性转基因小鼠模型中被激活，表明FXII驱动的接触系统被激活。Aβ可直接激活FXII，其下游介质可产生多种与AD病理相关的效应。FXII激活为FXIIa后启动内源性凝血级联反应，通过激肽释放酶裂解高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen, HMWK）释放缓激肽（bradykinin）。缓激肽释放及其受体激活可导致血流动力学改变、BBB损伤，并刺激炎症细胞因子和前列腺素释放。此外，激活的FXII通过激活FXI启动凝血级联，AD患者存在促血栓形成状态。纤维蛋白与Aβ形成复合物沉积于脑微血管，导致血管狭窄和灌注丧失。当BBB功能受损时，FXII驱动的接触系统下游介质进入脑实质，可引发炎症反应，形成凝血与炎症的恶性循环。因此，FXII是AD中凝血、神经炎症和神经退行性变之间的连接点，已被确定为潜在治疗靶点。先前研究显示，在脑β-淀粉样变性小鼠模型中靶向FXII的药理学干预可改善神经炎症和认知障碍，但FXII缺失对血管功能障碍的影响尚未研究。为此，研究人员在具有FXII缺陷的转基因脑β-淀粉样变性小鼠模型中研究了血栓形成易感性、血管功能障碍、Aβ沉积和认知行为。

**主要技术与方法**

研究人员使用了四种实验组：转基因arcAβ小鼠（过表达人APP695，携带瑞典和北极（E693G）突变，该品系发展为严重CAA并伴有血管形态改变、血管密度降低、低灌注、血管反应性受损、BBB损伤和脑微出血（cerebral microbleeds, CMB））、FXII^?/?小鼠（具有正常止血能力但免受病理性血栓形成）、arcAβ/FXII^?/?杂交小鼠及非转基因同窝对照（NTL）。所有动物约15月龄，雌雄兼有。行为学测试依次进行旋转杆实验、旷场实验和巴恩斯迷宫。体内动脉血栓模型采用光化学损伤颈总动脉，记录血管闭塞时间。磁共振成像用于计数CMB。BBB渗漏采用台盼蓝（Trypan Blue, TB）外渗测定。凝血检测包括FXII血浆水平ELISA、活化部分凝血活酶时间（aPTT）和纤维蛋白原水平测定。组织学分析采用免疫荧光（IF）和DAB染色，使用Aβ、CD31、Iba1和GFAP抗体，硫黄素S染色检测Aβ斑块。显微图像使用ImageJ和Ilastik分析。统计分析采用非参数检验（Wilcoxon检验、Kruskal-Wallis检验）及重复测量双因素方差分析（RM two-way ANOVA），并计算效应量Cohen's d。

**研究结果**

**3.1 arcAβ小鼠动脉血栓形成易感性增高被FXII基因缺失逆转**

研究人员首先测量了各组血浆FXII水平，确认FXII^?/?和arcAβ/FXII^?/?小鼠无血浆FXII。有趣的是，arcAβ小鼠血浆FXII水平显著低于NTL（29.0±6.0 vs. 37.3±7.6 μg/mL, p=0.03），提示Aβ存在时FXII被消耗，接触系统被激活。体内光血栓形成实验中，arcAβ小鼠的血管闭塞时间显著短于NTL和arcAβ/FXII^?/?（16.1±5.2 vs. 29.2±11.8和32.1±9.1 min，p=0.0397和p=0.0154），表明arcAβ小鼠更易形成动脉血栓。FXII基因缺失使arcAβ/FXII^?/?的闭塞时间与NTL无差异。各组间血流量、心率、组织因子活性、血浆纤维蛋白原水平和aPTT（除FXII缺失组延长外）均无显著差异。

**3.2 FXII基因缺失减轻arcAβ/FXII^?/?小鼠的BBB损伤**

TB外渗在NTL和FXII^?/?小鼠脑切片中缺失，arcAβ小鼠可见皮层中等大小血管（推测为皮层穿透小动脉）周围轻微渗漏，毛细血管无渗漏。与arcAβ小鼠相比，arcAβ/FXII^?/?小鼠TB外渗面积减少45%（3.3±1.3 vs. 1.8±1.0% TB面积，p=0.036）。相对于Aβ沉积程度的TB外渗在FXII缺失后趋于减少（45.9±16.8 vs. 24.7±10.9% TB/Aβ，p=0.0539），但两组Aβ斑块沉积程度相似。

**3.3 arcAβ/FXII^?/?小鼠CMB负荷降低**

CMB在arcAβ小鼠中非常突出，arcAβ/FXII^?/?小鼠也有CMB，但计数显示arcAβ/FXII^?/?的CMB负荷比arcAβ减少一半（41±26 vs. 81±27，p=0.012，Cohen's d效应量=1.5）。NTL和FXII^?/?组几乎无CMB。CD31免疫荧光染色显示各组血管密度无差异。

**3.4 FXII基因缺失不改变arcAβ/FXII^?/?小鼠的神经炎症**

Iba-1（小胶质细胞标志）和GFAP（星形胶质细胞标志）免疫组化定量显示，arcAβ和arcAβ/FXII^?/?小鼠在皮层和海马的Iba-1及GFAP免疫反应性均显著高于NTL和FXII^?/?小鼠，但arcAβ与arcAβ/FXII^?/?之间无差异，表明FXII缺失不影响Aβ诱导的胶质细胞活化。

**3.5 FXII缺失不改变arcAβ/FXII^?/?小鼠的Aβ沉积**

硫黄素S染色定量显示，皮层Aβ斑块负荷最高，海马和丘脑中等，尾壳核极少。arcAβ和arcAβ/FXII^?/?小鼠在皮层（2.6±0.6 vs. 2.4±1.0%）、海马（1.1±0.4 vs. 1.3±0.7%）、丘脑（0.8±0.4 vs. 0.9±0.6%）和尾壳核（0.3±0.2 vs. 0.3±0.2%）的Aβ负荷均无显著差异。

**3.6 FXII基因缺失改善arcAβ小鼠的认知表现**

巴恩斯迷宫测试中，学习阶段所有组均学会找到目标箱（日效应显著，p<0.0001），但基因型效应显著（p<0.0001）。NTL比arcAβ学习更快（p=0.0012），FXII^?/?表现优于arcAβ（p<0.0001）和arcAβ/FXII^?/?（p=0.0003），但arcAβ与arcAβ/FXII^?/?在潜伏期上无差异。然而，搜索策略分析显示，NTL、FXII^?/?和arcAβ/FXII^?/?小鼠随测试天数增加采用空间策略的比例增加，而arcAβ小鼠主要采用序列策略，提示arcAβ存在海马依赖的记忆缺陷，而FXII缺失部分恢复了空间策略使用。在探索试验中，arcAβ小鼠在目标象限的时间与25%机会水平无显著差异（40.1±33.1%），而NTL、FXII^?/?和arcAβ/FXII^?/?均显著高于机会水平（分别为51.1±20.9%、40.5±19.5%和50.1±20.5%，p=0.0001、p=0.0008、p=0.002），表明FXII缺失改善了空间记忆保持。旷场和旋转杆实验显示各组运动能力无差异，排除了非认知因素的干扰。

**讨论与结论**

**讨论总结**

本研究表明，FXII缺乏可减轻arcAβ小鼠模型中Aβ介导的血管和认知功能障碍。arcAβ小鼠血浆FXII水平降低，提示Aβ激活了FXII驱动的接触系统。FXII缺失使动脉血栓形成时间恢复正常，减轻BBB渗漏（减少45%）并降低CMB负荷（减少50%）。这些改善发生在Aβ沉积和胶质细胞活化无变化的情况下，表明FXII的作用独立于Aβ神经病理学。与先前使用TgCRND8模型的研究不同，本研究中FXII缺失未改变神经炎症，可能因模型差异或疾病阶段不同。认知方面，FXII缺失改善了arcAβ小鼠的空间学习策略和记忆保持，表明血管功能的改善带来了认知获益。FXII作为治疗靶点具有优势：遗传性FXII缺乏不引起异常出血，FXII^?/?小鼠无自发性出血，且在本研究中FXII缺失甚至减少了CMB，提示FXII靶向治疗可能规避传统抗凝治疗的出血风险。局限性包括：使用组成性基因敲除模型可能不同于急性治疗干预；仅在单一转基因模型的晚期阶段研究；下游分子机制未详细探究。未来需在多种模型和疾病阶段验证，并研究缓激肽信号、纤维蛋白沉积、凝血因子活性等具体通路。

**研究结论**

研究人员已证明，消除FXII驱动的通路是在已建立的AD小鼠模型中改善BBB损伤和促血栓形成状态的有效且安全的方法。对血管功能的影响与认知缺陷的改善相关，且独立于Aβ沉积和胶质细胞的组织学变化。因此，靶向FXII的治疗策略可能成为减轻AD和CAA中脑和全身血管功能障碍的有前景的治疗方法。