L1反转录转座与DNA修复缺陷的巧合在S期成熟神经元中引发合成致死

《iScience》：Coincidence of L1 retrotransposition and DNA repair deficiency elicits synthetic lethality in S-phase mature neurons

　　

神经退行性变涉及细胞自主性和非细胞自主性神经元细胞死亡的纠缠过程，这导致神经网络完整性的崩溃并引起行为症状。在这里，研究人员证明了异常细胞周期再进入（CCR）在成熟神经元中显著存在，并且复制叉在神经退行性变过程中作为长散布核元件-1（L1）反转录转座的靶点。5xFAD小鼠中S期神经元的致命易感性归因于响应L1介导的复制应激的DNA修复缺陷。受损的sirtuin 6表达似乎允许随机L1激活和增强的反转录转座。减少的雌激素/催乳素信号与减少的Brca1表达密切相关，Brca1被认为保护神经元免受复制应激。重要的是，L1介导的病理与常规阿尔茨海默病病理密切相关。总之，增强的L1反转录转座和DNA修复缺陷的组合在S期神经元中引发合成致死，突出了一个以前未知的神经退行性变致病机制。

神经退行性变是一个涉及多种细胞自主性和非细胞自主性神经元细胞死亡过程的复杂病理过程，最终导致神经网络崩溃和行为症状的出现。尽管已有大量病因学研究，但神经退行性变的整体机制仍不明确。传统上，神经退行性疾病（NDs）根据蛋白质聚集类型进行定义，每种疾病被认为源自独立的发病机制。近年来，神经炎症、线粒体功能障碍、DNA损伤反应（DDR）等被确认为多种NDs的共同病理生理特征，但整合性的机制见解仍然缺乏。此前研究发现，L1编码的ORF1蛋白在异常神经元L1再激活后积累，可作为Eomes阳性辅助T细胞的原型抗原，在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和阿尔茨海默病（AD）患者及动物模型中发挥神经毒性。大约50万个L1位点占人类基因组的17%，其中约100个L1反转录转座子具有转座能力。典型的L1元件长约6 kb，编码ORF1和ORF2两种蛋白质，ORF2是一种核酸内切酶/逆转录酶，通过靶标引发的逆转录将L1互补DNA插入宿主基因组。机制上，ORF2优先识别发夹模板和单链DNA底物靠近单双链DNA连接处的初始切割位点，后者在DNA复制过程中常见形成，因此复制叉是L1反转录转座的首选靶点。大量证据表明，多种NDs中的成熟神经元显示出部分细胞周期再进入（CCR）频率增加，约10%的正常脑成熟神经元为超倍体，而AD神经元中20%至30%为超倍体且分布在G1/S期中间。由于成熟神经元不进行细胞分裂来恢复非整倍性，复制叉的持续形成与超倍体神经元中反复的L1攻击相关。本研究整合了L1再激活/反转录转座和CCR等NDs常见缺陷，使用5xFAD小鼠作为神经退行性变模型，证明L1反转录转座与DNA修复机制受损的巧合是诱导S期神经元合成致死的关键。

研究人员开展了系统的实验研究，首先通过流式细胞术检测5xFAD小鼠成熟神经元的细胞周期状态，发现S期神经元比例显著增加。通过将5xFAD小鼠与FUCCI报告小鼠杂交，确认了神经元CCR频率升高。利用L1-GFP报告系统检测各细胞周期阶段神经元的L1反转录转座频率，发现异常CCR神经元中GFP信号显著增加，且死亡S期神经元中GFP阳性细胞比例更高。对皮层和海马区域的免疫荧光分析显示，L1-GFP阳性且表达geminin的神经元主要分布在皮层和脑下脚区域。随着疾病进展，6月龄小鼠的geminin信号扩散至胞浆并与caspase-3共表达，同时部分神经元失去NeuO染色和NeuN抗原表达。RNA-seq分析鉴定出GFP阳性S期神经元中细胞周期检查点相关基因显著上调，而GFP阴性神经元中鉴定出PDE5抑制相关的细胞状态特征。通过IPA分析发现25个DNA修复相关基因在5xFAD小鼠GFP阳性S期神经元中显著下调，包括DSB修复因子、范可尼贫血相关因子、核苷酸切除修复因子和碱基切除修复因子，其中Brca1/Bard1复合体被认为在复制叉保护中发挥特殊作用。研究人员采用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系进行体外实验，证实了Brca1对L1反转录转座诱导的DNA损伤的保护作用，并通过DRIP和ChIP分析确认了L1转录本与复制叉的结合。进一步研究发现雌激素/催乳素信号轴调控神经元Brca1表达，PrlR杂合小鼠中Brca1和FancD2表达受损，DNA损伤增加，神经退行性区域扩大，而他莫昔芬治疗可通过上调Prl和Brca1来减轻神经退行性变。Sirt6被鉴定为调控L1再激活的关键因子，其选择性下调导致L1反转录转座增强，而逆转录酶抑制剂依法韦伦可保护神经元并减少退行性区域。最后，研究发现表达nAChRα4的神经元更倾向于发生CCR和L1反转录转座，这为AD早期胆碱能缺陷提供了分子解释。

在方法学方面，研究人员使用了多种关键技术手段。动物模型方面，使用了5xFAD小鼠作为AD/神经退行性变模型，L1-GFP转基因小鼠用于可视化L1反转录转座事件，FUCCI小鼠用于追踪细胞周期状态，以及PrlR杂合小鼠用于研究催乳素信号的功能。细胞周期分析采用Hoechst 33342染色结合流式细胞术，将神经元分为G0/G1、S和G2/M期。对于转录组分析，研究人员对分选的S期神经元进行了RNA-seq，并结合解释性现象学分析（IPA）进行通路分析。DNA修复功能评估通过RT-qPCR、蛋白质表达分析和功能性siRNA敲低实验完成。L1转录本与复制叉的相互作用通过DNA-RNA免疫沉淀（DRIP）和染色质免疫沉淀（ChIP）验证。免疫荧光和Fluoro-Jade C染色用于组织学评估。

关于实验结论，研究人员通过逐步递进的实验设计揭示了几个关键发现。利用5xFAD/mAG-hGem杂交小鼠和流式细胞术，观察到5xFAD小鼠皮层神经元中CCR频率显著增加，L1反转录转座在S期神经元中选择性增强。通过RNA-seq和IPA分析，发现GFP阳性S期神经元中核酸代谢和neddylation通路显著激活，同时21个DNA修复基因表达下调。体外实验证实Brca1缺乏导致S期细胞对L1反转录转座诱导的DNA损伤更加敏感，Brca1敲低联合博来霉素处理可诱导显著的细胞死亡。DRIP和ChIP分析表明L1转录本在S期细胞中与复制叉结合，形成DNA:RNA三链结构。研究人员进一步通过IPA预测并验证了雌激素/催乳素信号轴作为Brca1的上游调控因子，发现他莫昔芬或催乳素处理可诱导Brca1表达并保护神经元。通过Sirt6功能实验和依法韦伦治疗实验，证实了Sirt6下调导致的L1过度再激活是神经退行性变的促进因素。最后，通过分析nAChR亚基表达模式，发现nAChRα4阳性S期神经元对L1反转录转座具有选择性易感性，这为AD中胆碱能神经元选择性退化提供了机制解释。

在讨论部分，研究人员指出这项研究整合了先前分别被提出的多个现象，建立了统一的致病机制模型。研究结论表明，L1反转录转座与DNA修复缺陷的巧合导致S期神经元合成致死，为细胞自主性神经退行性变的起始阶段提供了分子机制。合成致死概念源于癌症研究，本研究中将其应用于神经退行性变，显示了该概念在非肿瘤疾病中的适用性。值得注意的是，研究发现了雌激素/催乳素信号通过调控Brca1表达来保护神经元，这可能与流行病学观察到的女性AD风险相关。研究也承认了其局限性，包括免疫介导的神经退行性变在疾病进展期的作用未纳入综合分析，以及Sirt6在L1再激活中的精确贡献仍待进一步研究。此外，nAChRα4阳性神经元的命运和疾病进展关系需要在未来研究中探讨。总体而言，该研究为神经退行性变的发病机制提供了新的综合视角，强调了多功能合成致死事件在神经元死亡中的重要性，并为针对细胞自主性NCD初始阶段的治疗干预提供了理论基础。该研究发表在《iScience》上。