比较蛋白质工程重定向肉毒梭菌蛋白酶的特异性

《Cell Chemical Biology》：Comparative protein engineering redirects the specificity of Clostridium botulinum proteases

　　

肉毒杆菌神经毒素血清型A和E（BoNT/A和BoNT/E）切割SNAP25，并广泛用于治疗应用。重定向其蛋白酶结构域LC/A和LC/E的底物特异性，可将其应用扩展至新的治疗靶点。研究人员报道了一种整合先前诱变、生物信息学和结构见解的比较蛋白质工程策略，用于重编程LC蛋白酶的特异性。定向进化产生了含14个突变的LC/A变体，其对SNAP23的特异性较先前报道的工程蛋白酶高273倍。LC/A工程的见解随后指导了六轮定向进化，产生了含8个突变的LC/E变体，其对SNAP29的切割活性提高了26,000倍，且对SNAP25无可检测活性。重要的是，两种工程蛋白酶在生理相关的底物和盐浓度下均保持其改变的底物偏好。总之，这些发现确立了比较蛋白质工程作为重定向肉毒杆菌神经毒素蛋白酶的有效框架。

**比较蛋白质工程重定向肉毒杆菌神经毒素蛋白酶特异性——论文解读**

**一、研究背景与现存问题**

治疗性蛋白酶的临床应用高度依赖其底物特异性，即选择性切割目标底物而避免脱靶效应的能力。肉毒杆菌神经毒素（Botulinum neurotoxin, BoNT）的轻链（light chain, LC）蛋白酶是自然界中特异性最高的蛋白酶之一，其中LC/A可识别约60个底物残基，LC/E识别约19个残基。BoNT/A和BoNT/E均以突触体相关蛋白25（SNAP25）为底物，已被广泛应用于临床治疗。然而，将LC蛋白酶的底物特异性重定向至其它治疗靶点，有望大幅拓展其临床应用范围。SNAP23在多种组织的囊泡融合中发挥关键作用，而SNAP29参与自噬通路，自噬在多种癌症中被上调，因此SNAP29被视为有前景的抗癌治疗靶点。已有研究初步尝试将LC/A重定向至SNAP23，但所得变体在生理盐浓度条件下特异性不足。因此，如何在接近生理条件下实现高效、特异的LC蛋白酶底物重定向，是该领域面临的核心挑战。

**二、研究内容与结论**

研究人员提出了一种比较蛋白质工程（comparative protein engineering）策略，整合先前诱变数据、生物信息学分析和结构生物学见解，对LC/A和LC/E进行底物特异性重编程。通过11轮定向进化，获得含14个突变的LC/A变体ARd11C，其对SNAP23的特异性较起始变体omLC/A提高273倍。LC