《Biofilm》：Plasmid Encoded
mrk Gene Cluster Promotes Biofilm Formation, Environmental Persistence, and Invasiveness in
Salmonella Thompson
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生物膜形成是一种基本的生存策略，使细菌能够在不同环境和宿主中持续存在。虽然编码III型菌毛(Type 3 fimbriae)的mrk基因簇(mrk gene cluster)是肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中公认的生物膜形成决定因素
生物膜形成是一种基本的生存策略，使细菌能够在不同环境和宿主中持续存在。虽然编码III型菌毛(Type 3 fimbriae)的mrk基因簇(mrk gene cluster)是肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中公认的生物膜形成决定因素，但其在肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)中的存在和功能意义仍不明确。在本研究中，研究人员在一个临床汤普森沙门氏菌(Salmonella Thompson)分离株中鉴定到一个由高度接合性IncX1质粒携带的质粒编码mrkABCDF基因簇。利用CRISPR/Cas9介导的含mrk的Tn6011转座子敲除、质粒消除、靶向基因缺失和遗传互补，研究人员系统地剖析了mrkABCDF基因对生物膜形成及相关表型的贡献。mrk基因簇的缺失导致生物膜生物量显著减少，同时细菌运动性增加。III型菌毛仅在mrk阳性细胞表面检测到，证实了其在表面附着中的结构作用。mrk操纵子从IS1相关启动子强表达，绕过经典的MrkH依赖性调控。功能上，mrk表达增强了细菌对干燥和氧化应激的耐受性，并降低了对巨噬细胞吞噬作用的敏感性。在体内，mrk阳性菌株表现出增强的胃肠道定植和组织侵袭能力。值得注意的是，碳青霉烯类抗生素在抑制mrk介导的生物膜形成方面表现出卓越功效，表明其具有治疗生物膜相关感染的优越潜力。研究人员的发现表明，质粒编码的mrkABCDF基因可作为肠道沙门氏菌生物膜形成的关键结构和功能决定因素。携带mrk的IncX1质粒的水平传播可能促进具有增强环境持久性和宿主定植潜力的生物膜适应性沙门氏菌谱系的出现。
非伤寒沙门氏菌(Non-typhoidal Salmonella, NTS)是全球重要的食源性病原体，每年引起约9380万例感染和15.5万例死亡。侵袭性非伤寒沙门氏菌(invasive non-typhoidal Salmonella, iNTS)可导致危及生命的系统性感染，2021年全球约有50.9万病例。生物膜(Biofilm)形成是细菌在环境和宿主中持久存活的关键策略，然而沙门氏菌中负责生物膜形成的mrk基因簇(mrk gene cluster)研究不足。该基因簇编码III型菌毛(Type 3 fimbriae)，在肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中已被证实与生物膜形成密切相关。本研究从一例糖尿病足感染患者中分离到一株携带IncX1质粒编码的mrkABCDF基因簇的汤普森沙门氏菌(Salmonella Thompson)，旨在系统解析该基因簇对生物膜形成、环境适应性、侵袭性、肠道定植和抗生素敏感性的影响，并探讨水平基因转移在沙门氏菌致病潜力塑造中的作用。论文发表在《Biofilm》。
研究人员获取的临床菌株JNQH950来自中国某三级医院一名58岁糖尿病足感染患者的足部分泌物，经血清分型为汤普森沙门氏菌。主要关键技术方法包括：全基因组测序与比较基因组分析；利用CRISPR/Cas9系统敲除含mrk的Tn6011转座子或消除整条IncX1质粒；通过pGGTOX系统将aac(3’)-IV抗性标记插入非编码区或替换mrkCD；构建mrkABCDF遗传互补菌株；结晶紫染色定量生物膜；软琼脂游泳运动测定；S1-PFGE验证质粒消除；透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察菌毛；干燥、酸、高渗及氧化胁迫下的活菌计数与衰减率分析；RAW264.7巨噬细胞吞噬实验；RT-qPCR检测抗生素条件下mrk基因表达；小鼠口服感染结合生物发光成像评估肠道定植和全身扩散；全基因组测序验证突变株无脱靶突变。
结果部分：
3.1 基因组组织与序列保守性：通过全基因组测序和BLAST比对，发现IncX1质粒pJNQH950-3长40,394 bp，携带mrkABCDF基因簇，基因顺序与肺炎克雷伯菌KpSC参考位点一致，但位于IS1相关的Tn6011转座子中，且缺失mrkHIJ调控模块。MrkA、MrkB、MrkC、MrkD和MrkF的氨基酸同源性分别为99.5%、96.7%、100%、97.6%和99.5%，表明结构基因高度保守。
3.2 IncX1来源的mrkA启动子活性增强：利用sfGFP报告系统测定启动子活性，结果显示IncX1启动子的相对活性为12.93±0.30，而KpSC启动子为1.07±0.04，表明IncX1启动子活性比KpSC启动子高12倍以上。
3.3 CRISPR-Cas9编辑实现mrk簇切除或IncX1质粒丢失：研究人员使用pCasCure系统成功获得了ΔTn6011（JNQH1100）和ΔIncX1（JNQH1093）突变株，通过PCR扩增和S1-PFGE确认了基因敲除和质粒消除。
3.4 mrk基因簇增强生物膜形成并降低泳动能力：结晶紫染色显示，mrk缺失株的生物膜生物量显著低于野生型，而互补mrkABCDF可恢复生物膜形成；软琼脂运动性实验显示，缺失IncX1质粒或Tn6011转座子后泳动圈直径显著增大，互补后部分恢复，说明mrk基因簇与运动性之间存在负相关。
3.5 IncX1质粒高接合效率：接合实验显示，对照组JNQH1304的接合频率为35.7±4.5%，而mrkCD缺失株JNQH1402的接合频率升高至79.0±5.3%，约增加2.2倍，表明缺失mrkCD可增强质粒接合转移。
3.6 IncX1质粒的适应度代价：通过生长曲线计算最大生长速率μmax，ΔIncX1株的μmax显著高于野生型(P=0.0068)，而ΔTn6011株与野生型无显著差异(P=0.2192)，提示携带完整IncX1质粒会产生一定的适应度代价。
3.7 质粒稳定性：在无抗生素条件下连续传代110代后，携带IncX1质粒的菌落比例几乎没有下降，质粒丢失率接近0%，表明该质粒在非选择条件下稳定维持。
3.8 III型菌毛在野生型中可见：TEM观察显示，野生型JNQH950表面存在长约3–10 μm的丝状结构，符合III型菌毛形态，而mrk敲除株中未观察到该结构，证实这些菌毛由mrk基因簇编码。
3.9 mrk基因簇增强环境胁迫生存
