单细胞转录组驱动的搭载仿生纳米细胞起搏器的级联响应水凝胶设计用于衰老骨再生

《Biomaterials》：Single-Cell Transcriptomic-Driven Design of Cascade-Responsive Hydrogel with Bioinspired Nanocellular Pacemaker for Aged Bone Regeneration

　　

摘要

年龄相关的骨缺陷由于衰老的骨髓间充质干细胞（BMSCs）和促炎巨噬细胞之间的恶性循环而修复不佳。我们通过单细胞转录组学揭示了昼夜节律紊乱是潜在的驱动因素，并提出了一种“修复内部时钟，重编程外部免疫”的策略。受心脏起搏器感知信号和校正节律的启发，我们设计了具有“感知 - 释放 - 调节”范式的纳米细胞起搏器（AMC），用于衰老骨再生。AMC 由负载褪黑素的钴基金属有机框架（MOF）组成，该框架包覆了源自新一代益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌的膜囊泡。钴基 MOF 充当人工传感器，特异性感知衰老相关信号，并在衰老微环境中释放褪黑素。褪黑素的靶向递送通过精确调节昼夜节律来抑制 p53 和 TNF 信号通路，从而修复内部时钟并使 BMSCs 恢复活力。与此同时，AMC 上的益生菌膜主动将巨噬细胞重编程为衰老龛中的促再生 M2 表型。为了实现微创递送，开发了一种具有响应活性氧的硼酸酯键的双网络水凝胶，用于 AMC 的时空释放。在衰老小鼠中，这种级联响应治疗系统通过打破衰老 - 炎症恶性循环，在 4 周内完全修复骨缺陷，为年龄相关的组织修复提供了一种新的“细胞起搏”范式。

引言

随着全球老龄化以前所未有的速度加速，年龄相关的骨缺陷已成为一个紧迫且研究不足的临床挑战，其特征是骨密度低、自我修复能力下降、残疾风险增加和死亡率高 [1], [2]。值得注意的是，目前针对低骨密度骨缺陷的临床一线策略和探索性干预措施，如活性氧（ROS）清除和炎症抑制，长期专注于骨质疏松性骨缺陷 [3], [4], [5], [6], [7]。然而，以细胞衰老和龛恶化为特征的年龄相关骨缺陷在很大程度上被忽视，使得这一新兴临床问题缺乏有效治疗。衰老的骨髓间充质干细胞（BMSCs）和促炎（M1）巨噬细胞之间的恶性循环建立了一个敌对的龛，限制了年龄相关骨缺陷中的骨再生 [8]。协同打破这一循环，包括逆转细胞衰老和减轻巨噬细胞炎症，代表了一种有前景但未被充分利用的治疗途径。然而，BMSC 衰老的潜在核心上游机制仍然不明，需要对衰老骨微环境进行全面表征。

为了调查潜在的病理变化，我们对人骨组织的单细胞 RNA 测序（RNA-seq）数据集以及 BMAL1 和 CLOCK 基因敲低的 BMSC 的 bulk RNA-seq 数据集进行了全面分析。这些结果表明，昼夜节律紊乱是 BMSC 衰老的根本上游驱动因素和主要启动者（图 1）。具体而言，衰老的 BMSCs 表现出 BMAL1 和 CLOCK 的异常表达，它们是昼夜节律钟的核心基因，据报道可驱动钟控基因（CCGs）的节律性表达 [9], [10]，参与骨发育和稳态 [11], [12]。越来越多的证据表明，昼夜节律可以促进组织修复 [13], [14], [15], [16]，这为衰老相关修复提供了一个有前景的目标。因此，修复驱动 CCGs 节律性表达的细胞内部时钟可能是衰老 BMSCs 恢复活力的一个迷人策略。褪黑素是一种关键的昼夜节律调节剂，在老年人中水平下降，是通过调节昼夜节律修复内部时钟的理想治疗候选者 [17]。然而，短半衰期和目标特异性缺乏要求一个具有按需和位点特异性作用的智能递送系统，以精确“重启”衰老 BMSCs 中的昼夜节律钟。

在临床心脏病学中，起搏器通过首先感知心脏信号然后递送电脉冲完美地纠正异常节律 [18]，这启发我们设计纳米细胞起搏器来调节衰老 BMSCs 的昼夜节律。心脏起搏器的“感知和调节”工作模式也通过将刺激感知与按需药物释放耦合，形成治疗年龄相关骨缺陷的“感知 - 释放 - 调节”范式，从而解决了褪黑素体内递送的挑战。另一方面，衰老骨微环境的特征是难以治疗的促炎状态，这形成了一个自我放大的“炎症 - 衰老”恶性循环，使用当前治疗策略极难逆转 [8]。据报道，新一代肠道益生菌 [19], [20] 嗜黏蛋白阿克曼菌（Akk）通过从肠道向骨组织释放外膜囊泡来延缓骨丢失 [21]。此外，据报道 Akk 的外膜蛋白 Amuc_1100 能有效促进 M2 巨噬细胞极化 [22]。因此，受肠 - 骨轴的启发，来自 Akk 的益生菌膜囊泡（PMVs）（AMVs）可能是调节衰老炎症微环境的迷人生物材料。

在此，在单细胞转录组学的指导下，并受临床心脏起搏器的启发，我们报道了一种基于纳米细胞起搏器（AMC）的治疗系统，该系统实施了一种“修复内部（细胞内）时钟，重编程外部（细胞外）免疫”的策略，以打破修复年龄相关骨缺陷时衰老 BMSCs 和促炎巨噬细胞之间的恶性循环（方案 1）。AMC 由负载褪黑素的钴工程化 ZIF-8（Co-ZIF-8）纳米颗粒组成，该颗粒包覆了 AMVs。就像心脏起搏器一样，钴基催化开关充当传感器，首先感知衰老龛的生物化学信号（ROS 和 H⁺），然后通过释放褪黑素来修复衰老 BMSCs 的内部时钟，从而调节昼夜节律。重置的昼夜节律抑制 p53 和 TNF 信号通路，使衰老 BMSCs 恢复活力。受肠 - 骨轴理论的启发，首次采用 AMVs 通过包覆 MC（负载褪黑素的 Co-ZIF-8）来重编程外部免疫，以驱动 M2 巨噬细胞极化，这也增强了衰老 BMSCs 的分化。为了实现微创临床转化，AMC 进一步通过双网络水凝胶（AMC-Gel）递送，其中第一网络由聚乙烯醇（PVA）与硼砂交联形成，第二网络由海藻酸钠（SA）与 Ca²⁺ 交联形成。AMC-Gel 易于注射并适应复杂形状的骨缺陷，并感知衰老微环境中的 ROS，基于硼酸酯逐渐降解并释放 AMC。总的来说，包括 AMC-Gel 的生化信号触发的降解和 AMC 的褪黑素感知 - 释放的两个连续响应事件构成了级联响应治疗系统。它可以逆转细胞衰老并重编程衰老免疫，在健康 BMSCs 和抗炎巨噬细胞之间形成良性循环，这为修复年龄相关骨缺陷提供了一种有前景的策略。

章节摘要

昼夜节律紊乱是衰老骨微环境中 BMSC 衰老的关键上游驱动因素

采用来自多物种（人类和小鼠）和各种测序技术（bulk RNA-seq 和单细胞 RNA-seq）的基因表达数据来调查衰老骨微环境（图 1A）。在基因表达综合（GEO）数据库搜索了来自衰老和年轻骨组织的 bulk RNA-seq 数据集（GSE285020）和单细胞 RNA-seq 数据集（GSE169396）[23], [24]。在 bulk RNA-seq 数据集中，鉴定了差异表达基因（DEGs）并富集在

结论

本研究确定昼夜节律紊乱驱动了年龄相关骨缺陷修复的失败，并开发了一种分层响应治疗系统来满足这一未满足的需求。通过将昼夜节律调节和免疫重编程集成到一个微创和 ROS 响应平台中，AMC-Gel 打破了衰老 - 炎症恶性循环，并在衰老小鼠中实现了完全骨缺陷修复。这项工作不仅为年龄相关骨缺陷提供了一种新策略

材料

六水合硝酸钴 (Co(NO₃)₂·6H₂O)、硼砂和氯化钙 (CaCl₂) 购自国药集团化学试剂有限公司。PVA、六水合硝酸锌 (Zn(NO₃)₂·6H₂O)、2-甲基咪唑、氯化十六烷基吡啶和褪黑素购自阿拉丁生物技术有限公司。β-甘油磷酸二钠盐、地塞米松和抗坏血酸购自 Sigma-Aldrich。SA 购自上海麦克林生化技术有限公司。总 SOD 检测试剂盒，

CRediT 作者贡献声明

彭保：调查。 谷慧云：撰写 – 初稿，调查，概念化。 吕晓东：调查。 曲文强：调查。 董宝廷：调查。 袁蒙：调查。 谌超：调查。 李彭城：调查。 张先正：撰写 – 审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，概念化。 虞爱西：监督，项目管理，资金获取

数据和材料可用性

评估论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充材料中提供。额外数据和源文件可在合理请求时从通讯作者处获得。

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本论文中报告的工作。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本论文中报告的工作。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金的资助 (22135005, 52333004 和 52588201)、湖北科技创新基地（平台）计划 (2025CCB005)、湖北卫生科技项目 (WJ2025Q024) 和武汉大学中南医院优秀博士基金项目 (ZNYB20240013)。

我们感谢武汉大学核心设施的郭雁莉小姐协助我们进行 SEM/EDS 映射分析。

谷慧云 | 彭保 | 曲文强 | 吕晓东 | 袁蒙 | 董宝廷 | 李彭城 | 谌超 | 虞爱西 | 张先正

武汉大学中南医院骨科创伤与显微外科部，中国武汉 430071