用于神经修复中同种异体移植的免疫抑制微粒

《Biomaterials Advances》：Immunosuppressive microparticles for allogeneic transplantation in nerve repair

　　

载有免疫抑制剂的微粒可用于治疗神经损伤。这些材料可能允许使用同种异体神经移植物和细胞疗法。载有他克莫司的微粒能够降低T细胞对同种异体神经组织的免疫反应。

周围神经是负责在中枢神经系统与身体其他部分之间传递运动、感觉和自主信号的轴突与雪旺细胞束，在跌倒、车祸或接触重型机械等物理创伤中极易受损。尽管周围神经具有再生能力，但损伤后的不完全恢复会导致感觉和运动功能的永久性缺陷以及慢性疼痛。目前，严重神经损伤的黄金标准外科干预手段是自体移植技术，即从患者自身其他部位获取健康神经移植物来修复受损区域，以恢复轴突再生长的结构连续性并提供自体雪旺细胞支持再生。然而，这种治疗本身会在供体部位造成神经损伤及相关并发症：特别是接受腓肠神经采集的患者，其感觉缺陷率高达93%，慢性疼痛率约为23%。此外，不到一半的病例在自体移植后能实现功能恢复。理想的替代疗法需要避免对健康组织造成损伤，提供引导和细胞支持，并提供促再生因子以促进轴突再生长。组织工程神经构造和同种异体神经移植物是两种有前景的替代方案。EngNT包含排列在稳定胶原水凝胶中的治疗性细胞，在大鼠坐骨神经损伤模型中已显示出与自体移植相当的功能结果。从器官捐献者中采集同种异体移植物则允许使用原生细胞神经组织及其高度复杂的结构，同时避免了供体部位的并发症。然而，这两种技术都包含可能被宿主免疫系统排斥的同种异体细胞。虽然全身递送免疫抑制剂他克莫司已被用于临床前保护神经同种异体移植物，但全身给药可能会产生不可接受的副作用。因此，研究人员开发了一种直接整合他克莫司微粒的移植物，旨在提供一种现成且易于植入的产品，以实现局部免疫抑制。研究人员探讨了使用载有他克莫司的微粒来保护两种用于神经修复的同种异体组织移植方法，得出局部递送他克莫司能够有效降低对同种异体神经组织的免疫排斥反应的结论。这项研究为神经修复中的同种异体移植提供了一种可行的局部免疫抑制策略，具有重要的临床转化意义。该论文发表在《Biomaterials Advances》。

在方法学上，研究人员主要采用了以下关键技术：使用电喷雾和单乳液技术制备载有他克莫司的聚己内酯（PCL）微粒；通过液相色谱-质谱联用技术检测他克莫司的释放及包封率；利用共聚焦显微镜评估EngNT中雪旺细胞的存活和排列情况。动物实验方面，样本队列来源于Dark Agouti（DA）大鼠和Lewis大鼠，采用大鼠坐骨神经损伤与修复模型，通过免疫组织化学技术检测移植物中T细胞、巨噬细胞浸润及轴突再生情况；并利用拉伸测试评估涂层神经的力学性能。

研究结果如下：
Electrosprayed tacrolimus-loaded microparticles
通过电喷雾技术成功制备了载有他克莫司的PCL微粒。研究结果表明，该微粒呈球形且形态一致，能够在超过60天的时间内持续释放他克莫司，且药物在聚合物基质中的包封率超过70%，证明其具备良好的缓释能力和药物包封效率。

Tacrolimus microparticles in EngNT
通过将微粒整合入EngNT并评估其对F7雪旺细胞的影响，发现含有他克莫司微粒的胶原蛋白水凝胶能够形成坚固的构造，且细胞存活率和排列方向性与标准EngNT组相比无显著差异。这表明将这种聚合物生物材料整合到细胞水凝胶中不会影响细胞的复杂收缩和排列机制。

In vivo immune response to EngNT with tacrolimus microparticles
通过将构造物植入MHC不匹配的大鼠坐骨神经损伤模型中，研究人员评估了体内的免疫反应。结果显示，未加药的EngNT组中CD8⁺细胞浸润显著增加，而载有他克莫司微粒的EngNT组中，CD4⁺和CD8⁺ T细胞的浸润均有所减少，其中CD4⁺细胞几乎降至无细胞构造的基线水平。这表明他克莫司微粒能够调节对植入同种异体细胞的T细胞免疫反应，且不影响动物的体重增长。

Nerve coating using single emulsion tacrolimus-loaded microparticles
通过单乳液技术制备的离散微粒与海藻酸钠水凝胶结合，在神经移植物表面形成均匀涂层。拉伸测试表明，该涂层未显著影响移植物的机械抗拉性能，其杨氏模量与天然神经组织相近。这证明该涂层方法可行且不破坏神经的力学完整性。

In vivo immune response to allografts with tacrolimus microparticles
在完全MHC不匹配的DA（RT1^av1）和Lewis（RT1^l）大鼠模型中，研究人员评估了涂层对同种异体移植物的保护作用。结果显示，未经处理的同种异体移植物中CD8⁺ T细胞数量显著高于同系移植组，而经10 mg他克莫司微粒涂层处理的移植物中CD8⁺ T细胞数量显著降低，达到接近同系移植组的水平。CD4⁺ T细胞和CD68⁺巨噬细胞数量在各组间无显著差异。这表明该涂层能够有效减轻细胞毒性T细胞介导的免疫排斥。

In vivo axonal regeneration in allografts with tacrolimus microparticles
通过评估近端移植物区域的轴突再生情况，发现未经处理的同种异体移植物中轴突计数显著低于同系移植组。虽然使用他克莫司微粒治疗后轴突计数呈现增加趋势，但差异并未达到统计学显著性。这表明在此剂量和三周的时间点下，该治疗对早期轴突再生的促进作用有限。

总结讨论与结论部分：
研究人员旨在应用单一策略，即他克莫司微粒的局部应用，为神经修复中的两种同种异体组织提供免疫抑制。研究表明，电喷雾制备的他克莫司PCL微粒具有长达数月的缓释特性，且能安全整合入细胞水凝胶中而不影响雪旺细胞的存活与排列。在体内实验中，局部递送他克莫司能够有效降低同种异体移植物中CD8⁺ T细胞的浸润，且避免了全身给药带来的体重下降等副作用。研究结论表明，使用单乳液法制备的离散微粒结合海藻酸钠涂层是一种可行且有效的局部免疫抑制策略，能够显著减少大鼠同种异体神经修复中的细胞毒性T细胞反应。尽管在早期轴突再生方面未观察到显著差异，但这为开发预载他克莫司微粒的神经移植物奠定了基础。未来的研究应进一步探索更高剂量微粒的效果，并在更长的实验周期内评估轴突再生和功能恢复情况，同时对比无涂层对照组以优化这一具有临床转化潜力的技术。