中国云南省羊种布鲁氏菌菌株的核心基因组多位点序列分型特征

《Biosafety and Health》：Core genome multilocus sequence typing characteristics of Brucella melitensis strains from Yunnan Province, China

　　

摘要

人类布鲁氏菌病是中国云南省一种重新出现的动物源性人兽共患疾病；然而，循环菌株的分子流行病学特征仍不清楚。在本研究中，研究人员应用细菌学方法、多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）和核心基因组多位点序列分型（core genome MLST, cgMLST）来探究菌株之间的流行病学关系。细菌学分析显示，在127株菌株中，9株被鉴定为羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis, B. melitensis）生物变种1型，118株为羊种布鲁氏菌生物变种3型，这些菌株分布于13个州市。在患者中，70.9%为男性，87.4%为接触牲畜的农民，95.3%年龄在41–80岁之间，感染高峰出现在夏秋农业季节（占病例的70.1%）。127株羊种布鲁氏菌被分为两种序列类型（sequence types, STs）：ST8（n = 116）和ST39（n = 11）。ST8广泛分布于中国北方，而ST39主要在中国西南地区（贵州省和四川省）有报道。这些数据表明，羊种布鲁氏菌序列类型ST8和ST39共同与云南省人群中的布鲁氏菌病流行相关。cgMLST分析将127株菌株分为8个簇（CI–VIII）和21种STs，其中19种STs包含来自至少两个城市、分离时间跨越两年的菌株。这些发现提示，该地区的布鲁氏菌病流行由具有高度遗传同源性的菌株驱动。全球cgMLST分析显示，本研究中的大多数菌株与中国北方的分离株具有高度遗传相似性，提示这些群体之间存在潜在的流行病学联系。优先监测优势ST8谱系对于有效的布鲁氏菌病控制和监测至关重要。

**中国云南省羊种布鲁氏菌菌株核心基因组多位点序列分型特征：一项系统的分子流行病学研究**

**一、研究背景与目的**

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（*Brucella*）细菌引起的一种重要全球性人兽共患传染病。在引起人类疾病的三种主要布鲁氏菌种中，羊种布鲁氏菌（*B. melitensis*）致病性最强，其次为猪种布鲁氏菌（*B. suis*），牛种布鲁氏菌（*B. abortus*）通常导致最轻微的临床表现。该病在全球范围内具有较高的发病率，保守估计每年新发病例约210万例，主要集中在非洲和亚洲地区。在中国大陆，羊群和山羊群中布鲁氏菌病的合并患病率从2000–2009年间的1.00%显著上升至2010–2018年间的3.20%；相应的人类报告病例从1950年的8例激增至2021年的69,767例，发病率从每10万人0.002例上升至4.949例。这一持续的流行主要由羊种布鲁氏菌引起，并受社会经济因素推动，已从中国北方扩展至南方地区。南方省份报告的布鲁氏菌病病例从2019年的4,310例（占全国总数的2.00%）激增至2023年的10,363例（占5.38%），其中云南省和四川省出现了显著的高发聚集区。然而，云南省循环菌株的群体结构和流行病学关系此前尚不清楚。

多位点序列分型（MLST）是用于布鲁氏菌分离株分子特征分析的标准基因分型技术。近年来，有研究提出了新型的布鲁氏菌全基因组核心基因组MLST（cgMLST）方案，能够精确界定布鲁氏菌菌株间的关系，适用于布鲁氏菌分子流行病学研究。已有研究证实cgMLST是伊朗布鲁氏菌分离株溯源分析的可靠且准确的方法。尽管如此，中国西南地区（尤其是云南省）的cgMLST数据仍然十分有限。本研究旨在通过整合细菌学方法、MLST和cgMLST，评估云南省人源羊种布鲁氏菌菌株的流行病学关系，为设计针对性的公共卫生和兽医干预措施提供科学依据。

**二、主要关键技术方法**

本研究采用以下主要技术方法：（1）常规细菌学鉴定：通过双相血培养瓶在生物安全三级（BSL-3）实验室中分离菌株，结合布鲁氏菌细胞表面蛋白31聚合酶链反应（BCSP-31 PCR）进行属水平鉴定，并利用单特异性血清A/M凝集试验和AMOS-PCR（abortus-melitensis-ovis-suis PCR）进行生物变种鉴定；（2）全基因组测序：使用Illumina Nextera XT文库构建试剂盒制备测序文库，在MGISEQ-2000平台上进行双端测序（2 × 150 bp），通过CLC Genomics Workbench进行基因组组装，并利用CheckM2评估基因组完整性，采用平均核苷酸一致性（ANI）分析确认菌种；（3）MLST分析：将组装基因组提交至Brucella MLST数据库，针对九个管家基因（*gap*, *aroA*, *glk*, *dnaK*, *gyrB*, *trpE*, *cobQ*, *omp25*, *int-hyp*）进行等位基因分配和序列类型（ST）确定；（4）cgMLST分析：使用chewBBACA v2.8.5流程，基于包含1,764个核心基因的标准化Brucella cgMLST方案进行高分辨率基因分型，并通过ReporTree v2.6.0进行层次聚类分析以界定遗传簇。菌株来源于2023年1月1日至2024年12月31日期间云南省多个医疗机构通过被动监测收集的布鲁氏菌病患者血液标本。

**三、研究结果**

**3.1 患者人口学特征与临床症状**

研究共从127名布鲁氏菌病患者中分离获得127株布鲁氏菌。人口学分析显示，男性90例（70.9%），女性37例；职业分布以接触牲畜的农民为主，占87.4%（n = 111），其他职业包括家务/无业人员5例、学生5例（有生奶饮用史）、商业服务人员1例，5例职业信息未记录。患者年龄范围为8至79岁，平均年龄50岁，其中51–60岁年龄组病例数最多（n = 40, 31.50%），其次为61–70岁组（n = 36, 28.35%）、71–80岁组（n = 25, 19.69%）和41–50岁组（n = 20, 15.75%），四个年龄组（41–80岁）合计占全部病例的95.28%。季节分布显示，第二季度（4–6月）病例数最多（n = 52, 40.94%），第三季度（7–9月）次之（n = 37, 29.13%），4月至9月为发病高峰。常见临床症状包括发热、乏力、肌肉和关节疼痛以及出汗。地理分布上，昆明市病例数最多（n = 34），其次为大理白族自治州（n = 23）和红河哈尼族彝族自治州（n = 19），其余州市病例数为1至10例不等。

**3.2 菌株菌落形态观察**

疑似菌落在布鲁氏菌琼脂平板上通常培养48–72小时后，形成圆形、凸起、表面光滑、半透明无色的菌落，呈油滴状，在透射光下显现微弱的蓝色荧光。这些菌落形态特征是实验室鉴定布鲁氏菌的关键初步诊断指标。

**3.3 菌种与生物变种鉴定**

所有分离株均通过BCSP-31 PCR确认为布鲁氏菌属，扩增出预期的223 bp片段。AMOS-PCR分析显示所有分离株均呈现特征性的731 bp扩增条带，鉴定为羊种布鲁氏菌。单特异性抗血清凝集试验进一步区分了生物变种：9株菌与A抗血清呈阳性凝集，118株菌与A和M抗血清均呈阳性凝集，从而确认9株为羊种布鲁氏菌生物变种1型，118株为生物变种3型。ANI分析显示所有菌株与羊种布鲁氏菌参考菌株具有最近的遗传相似性，均被鉴定为羊种布鲁氏菌。

**3.4 菌株地理分布与生物变种分布**

127株羊种布鲁氏菌分布于13个州市，其中昆明市最多（n = 34），其次为大理白族自治州（n = 23）、红河哈尼族彝族自治州（n = 19）、曲靖市（n = 10）、保山市（n = 8）、丽江市（n = 8）、昭通市（n = 7）、楚雄彝族自治州（n = 6）、怒江傈僳族自治州（n = 4）、玉溪市（n = 4）、迪庆藏族自治州（n = 2）、文山壮族苗族自治州（n = 1）和普洱市（n = 1）。生物变种1型分离自保山市（n = 1）、楚雄彝族自治州（n = 1）、大理白族自治州（n = 2）、红河哈尼族彝族自治州（n = 2）、昆明市（n = 2）和曲靖市（n = 1）；生物变种3型主要分离自昆明市（n = 32），其次为大理白族自治州（n = 21）和红河哈尼族彝族自治州（n = 17）等。数据表明羊种布鲁氏菌生物变种3型为优势且广泛分布的菌株，羊种布鲁氏菌已成为云南省重要的公共卫生挑战。

**3.5 MLST基因分型特征**

MLST分析将127株菌株分为两种序列类型：116株为ST8，其余11株为ST39。ST39为ST8的单基因座变异体（single-locus variant, SLV），仅在管家基因*glk*位点存在差异。ST8菌株分布于全部13个州市，而ST39仅在大理白族自治州（n = 6）、曲靖市（n = 2）、楚雄彝族自治州（n = 2）和昆明市（n = 1）检出。九个MLST位点的Simpson多样性指数分析显示，仅*glk*位点存在两种等位基因型，其余八个位点均为单态性。全国范围ST比较显示，ST8在大多数省份占优势，而ST39仅在四川、贵州和云南三个西南省份发现。

**3.6 cgMLST菌株遗传关系分析**

cgMLST分析将127株菌株分为8个簇（CI–VIII）和21种序列类型，其中19种STs包含来自2至8个城市（或地区）且分离时间跨越两年的菌株。ST11包含来自8个城市的17株菌，其次为ST15（7个城市15株）、ST16（5个城市13株）、ST5（5个城市11株）、ST12（5个城市10株）和ST4（3个城市9株），其余STs各包含至少来自两个城市（或地区）的菌株。这一结果表明不同地区的羊种布鲁氏菌菌株具有高度遗传相似性。两种STs（ST3和ST13）包含来自同一地理区域的菌株，提示菌株间具有密切的遗传相似性。此外，两种STs（ST6和ST13）各仅包含一株菌，提示仅少数病例为散发感染。

**3.7 全球比较分析**

全球cgMLST分析将本研究分离的所有菌株归属于东地中海谱系（Eastern Mediterranean lineage），其中14种STs与中国北方七个地区的菌株显示出密切的遗传关系，包括青海省（ST3）、内蒙古自治区（ST4, ST7–9, ST11, ST14）、甘肃省（ST10, ST17–18）、河北省（ST12）、辽宁省和山东省（ST15）以及青海省和吉林省（ST20–21）。四种STs（ST1, ST2, ST16和ST19）为本研究独有，未在其他地区鉴定到。这些发现表明，驱动云南省布鲁氏菌病流行的菌株与中国北方流行的菌株具有高度遗传相似性，提示存在潜在的跨区域流行病学联系。

**四、讨论与结论**

**讨论：** 本研究表明，云南省布鲁氏菌病患者以中老年男性农民为主，职业性接触牲畜是主要的感染因素，这与全国及周边省份（如贵州省）的调查结果一致。羊种布鲁氏菌生物变种3型为优势菌株且分布广泛，与该省羊只存栏量从2008年的843.27万只增长至2022年的1,371.89万只的趋势相符。MLST分析揭示ST8和ST39两种序列类型的共存，其中ST39作为ST8的单基因座变异体，提示其可能源自优势ST8谱系的近期克隆扩张。ST8在中国北方地区广泛流行，并正在向西南地区扩散；ST39在云南、四川和贵州三省的区域性循环模式提示存在区域传播链。cgMLST显著提升了分辨能力，将菌株细分为21种STs和8个簇，揭示了不同地区菌株间高度的遗传同源性，提示布鲁氏菌病在该地区的流行由高度相似的菌株谱系持续循环驱动。全球比较分析显示大多数云南省菌株与中国北方菌株具有高度遗传相似性，提示存在此前未被识别的跨区域流行病学关联。鉴于云南省布鲁氏菌病重新出现的严峻态势及大量患者就诊带来的实验室和临床暴露风险，加强实验室和临床工作人员的生物安全培训至关重要。

**结论：** 本研究确认羊种布鲁氏菌在云南省至少13个州市广泛流行，构成重大公共卫生问题。研究结果表明，云南省布鲁氏菌病预防和控制措施应优先针对羊种布鲁氏菌，特别关注ST8和ST39克隆复合体菌株。通过cgMLST分析，研究数据表明该地区人布鲁氏菌病传播可能呈现聚集性模式。本研究提供了重要的基因组学证据，揭示了关键的流行病学模式：本研究中所有分离株均归属于东地中海谱系。该研究为中国西南地区羊种布鲁氏菌的分子流行病学提供了重要见解，是云南省人源分离株近期的系统性分子特征研究。