《Cellular Signalling》：Inhibition of PARP-1 attenuates osteoarthritis progression by suppressing NF-κB signaling and alleviating chondrocyte senescence
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摘要骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征为软骨破坏、炎症和软骨细胞衰老，但目前尚无疾病修饰疗法。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 -1（PARP-1）已被证实与炎症和衰老有关，但其在 OA 发病机制中的作用仍未被完全阐明。在本研究中，我们利用体外和体内大鼠模型调查了 PA
摘要
骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征为软骨破坏、炎症和软骨细胞衰老，但目前尚无疾病修饰疗法。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 -1（PARP-1）已被证实与炎症和衰老有关，但其在 OA 发病机制中的作用仍未被完全阐明。在本研究中，我们利用体外和体内大鼠模型调查了 PARP-1 抑制对 OA 进展的影响。在体外，用白细胞介素 -1β（IL-1β）刺激大鼠软骨细胞以建立 OA 样表型。IL-1β刺激后 PARP-1 的表达和活性升高。用特异性 siRNA 抑制 PARP-1 可显著降低促炎介质（iNOS, COX2）和基质降解酶（MMP13, ADAMTS5）的表达。PARP-1 抑制还减轻了 IL-1β诱导的 NAD+耗竭和软骨细胞衰老，表现为 p16 表达降低和 SA-β-gal 阳性细胞减少，这些效应可被 SIRT1 抑制剂 EX527 部分逆转。在机制上，PARP-1 抑制通过减少 IκB 和 p65 磷酸化并抑制 p65 核转位来抑制 IL-1β诱导的 NF-κB 激活。免疫共沉淀实验揭示了 PARP-1 和 IκB 之间的相互作用。在体内，在前交叉韧带切断术（ACLT）诱导的大鼠 OA 模型中关节内注射 PARP-1 siRNA 缓解了软骨降解，番红 O/甲苯胺蓝染色和 Mankin 评分显示了这一结果。综上所述，这些发现表明 PARP-1 抑制通过抑制 NF-κB 信号通路和减轻软骨细胞衰老来减弱 OA 进展，表明 PARP-1 是 OA 的潜在治疗靶点。
引言
骨关节炎（OA）是最常见的关节炎形式，也是全球老年人慢性疼痛和残疾的主要原因 [1]，[2]。OA 是一种影响整个关节的复杂疾病，病理特征为关节软骨破坏和降解、软骨下骨重塑、滑膜炎以及韧带和肌肉等其他关节结构的改变 [3]。其主要临床表现包括关节疼痛、僵硬、畸形、关节周围肌肉萎缩，最终导致活动受限，显著降低患者的生活质量 [4]。由于其发病机制复杂且尚未完全阐明，目前尚无疾病修饰药物，使得 OA 本质上无法治愈。当前的治疗策略主要依赖于姑息治疗，如抗炎镇痛药和物理治疗 [5]，[6]。最终，大多数 OA 患者接受全关节置换手术。OA 主要影响老年人，近 40% 的 65 岁以上个体受到影响 [2]。鉴于全球人口老龄化加速，OA 对生活质量构成重大威胁，并造成巨大的经济负担。因此，阐明 OA 的发病机制并开发新的治疗策略仍然是亟待解决的关键挑战。
尽管 OA 的确切病因和机制尚未完全了解，但高龄、关节创伤、慢性炎症、遗传易感性和肥胖被广泛认为是导致其发生和进展的关键危险因素 [7]，[8]。这些因素通常协同作用。OA 的标志性病理特征是关节软骨退变 [4]。因此，与其他关节成分相比，软骨组织和软骨细胞已成为主要的研究焦点。关节软骨是一种独特的无血管组织，主要由丰富的 ECM 和嵌入的软骨细胞组成，在关节运动过程中发挥保护和支持作用 [4]，[9]。关节软骨的 ECM 主要由 II 型胶原（Col2）和蛋白聚糖组成 [9]。软骨细胞负责合成和分泌 ECM 成分以维持和修复软骨功能，但在特定条件下也可分泌基质降解酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）和聚集蛋白聚糖酶 [10]，[11]。虽然 OA 传统上不被归类为炎症性疾病，但局部关节炎症被公认为在软骨退变中起关键作用。在 OA 患者的滑液中发现多种炎症细胞因子水平升高，包括白细胞介素 -1β（IL-1β）、IL-6 和肿瘤坏死因子 -α（TNF-α） [12]，[13]。随后的研究表明，这些细胞因子抑制 ECM 合成和分泌，同时诱导 ECM 降解酶，从而推动软骨破坏。
高龄是 OA 的主要危险因素 [14]，[15]。生物体衰老归因于细胞衰老，OA 软骨细胞表现出衰老细胞的特征，如端粒缩短和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加 [16]。软骨细胞端粒随年龄缩短，这与 OA 患病率的年龄依赖性增加相一致 [17]，[18]。衰老细胞在正常软骨中不存在，但在患者样本的 OA 受累区域观察到。将衰老的软骨细胞移植到健康小鼠的膝盖中会诱导 OA 样变化，包括疼痛和软骨形态/组织学改变。因此，软骨细胞衰老被认为与 OA 发病机制密切相关。细胞衰老是指由压力触发的不可逆细胞周期停滞状态。衰老相关分泌表型（SASP）是衰老细胞的另一个定义特征，涉及分泌多种炎症细胞因子和生长因子，包括 GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、MCPs 和 MMPs [16]。许多 SASP 成分已被确认存在于 OA 组织或滑液中。SASP 可以持续关节内的局部炎症微环境，并对周围健康细胞产生不利影响 [15]，[18]。因此，炎症和细胞衰老可能是相互关联的，并共同导致 OA 软骨退变的发生和进展 [19]。近年来，大量关于骨关节炎的研究集中在炎症和衰老上。
聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 -1（PARP-1）是 PARP 酶家族中含量最丰富的成员。PARP-1 利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）合成聚（ADP-核糖）（PAR）链，并催化将 ADP-核糖基团转移到靶蛋白上，这一过程称为 ADP-核糖基化 [20]，[21]。研究表明，PARP-1 激活与各种炎症相关临床状况密切相关，药理学抑制 PARP-1 能有效缓解糖尿病、动脉粥样硬化和神经退行性疾病等疾病模型中的炎症 [22]，[23]。此外，PARP-1 激活会耗竭细胞内 NAD+库，导致 NAD+水平降低，这种下降会损害 NAD+依赖性抗衰老去乙酰化酶 SIRT1 的活性 [24]，[25]，[26]。相反，抑制 PARP-1 可保持细胞内 NAD+水平，增强 SIRT1 活性，并改善早衰细胞的功能。在老年小鼠的骨骼肌中也检测到 PARP-1 活性升高、NAD+水平降低和 SIRT1 活性降低 [27]。同样，作为与炎症和衰老密切相关的疾病，OA 关于 PARP-1 的研究有限。之前的研究在 OA 软骨细胞中鉴定出 PARP-1 过表达，并使用 shPARP-1 敲低其延缓 OA 进展，尽管确切机制仍不清楚 [28]。在本研究中，我们旨在调查 PARP-1 在 OA 发展中的作用及其对体外和体内大鼠软骨中 OA 相关分子的影响。
章节摘要
化学试剂与材料
EX527，一种特异性 SIRT1 活性抑制剂，购自 Selleck Chemicals。重组大鼠 IL-1β细胞因子购自 R&D Systems。本研究中使用的初级抗体如下：抗-PARP-1、抗-SIRT1、抗-iNOS、抗-MMP13、抗-COL2、抗-p65 和抗-p16 购自 Proteintech Group（武汉，中国），稀释比例为 1:1000；抗-PAR 购自 Santa Cruz Biotechnology, Inc.（Santa Cruz, CA, USA），稀释比例为 1:2000；抗-COX2、抗-phospho-p65、抗-phospho-IκB 和抗-IκB 购自 Cell
IL-1β刺激的鼠软骨细胞中 PARP-1 的表达和活性
首先，我们鉴定了我们分离的初级大鼠膝关节细胞。胶原 II（Col2）和蛋白聚糖是软骨细胞细胞外基质（ECM）的主要成分。研究表明，软骨细胞产生的 ECM 赋予关节表面灵活性并矿化 [9]。因此，Col2 的表达或 Col2 的免疫荧光可用于鉴定软骨细胞。如图 1A 所示，初级大鼠膝关节细胞表现出典型的软骨细胞形态，呈圆形或
讨论
OA 是老年人常见的退行性疾病，也是关节疼痛和活动能力受损的主要原因 [2]。然而，OA 的病理生理学尚未完全了解，目前尚无疾病修饰疗法；治疗主要是对症的 [8]。迫切需要新的治疗策略。PARP-1 是 PARP 酶家族中含量最丰富的成员，它可以利用 NAD+合成聚（ADP-核糖）（PAR）链并催化 ADP-核糖的转移
CRediT 作者贡献声明
张瑞: 写作 – 初稿，方法论，调查，概念化。 王玲英: 可视化，调查，数据管理。 裴文斌: 可视化，验证，软件，方法论。 屈云昆: 可视化，监督，软件。 有宏波: 写作 – 审查与编辑，资源，项目管理，资金获取，概念化。
伦理声明
动物研究已获华中科技大学教学与研究动物护理与使用委员会审查和批准。
作者贡献
HY 和 RZ 构思和设计实验。RZ 和 LW 进行实验。RZ 进行体外实验并撰写文章。WP 和 YQ 贡献于实验操作和数据分析。HY 监督项目并为研究提供资金。
资助
本工作得到了 国家自然科学基金（项目编号：81772390）的资助。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在利益冲突：有宏波报告获得了 国家自然科学基金 的资金支持。如果有其他作者，他们声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些可能影响本文报告的工作。
Rui Zhang|Lingying Wang|Wenbin Pei|Yunkun Qu|Hongbo You
康复医学科，浙大医学院附属邵逸夫医院，中国浙江省杭州市东青春路 3 号，310016
