通过AKAP1 silence和钙过载实现的三重途径协同性细胞衰老诱导：一种用于抗肺纤维化研究的适配体功能化DNA酶纳米平台

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Triple-pathway synergistic senolysis via AKAP1 silencing and calcium overload: An aptamer-functionalized DNAzyme nanoplatform for anti-pulmonary fibrosis research

　　

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  一种三重途径协同策略，结合钙过载、AKAP1沉默和caspase-8激活来诱导细胞衰老。
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  L1CAM适配体功能化的纳米平台能够定向递送至衰老的II型肺泡上皮细胞。
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  酸响应性CaCO₃核心可实现姜黄素（CUR）、Mn²⁺和DNA酶的协同释放，其中Mn²⁺同时充当DNA酶的辅因子和caspase-8的激活剂。
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  可吸入纳米平台能有效清除衰老细胞，减轻纤维化，并在体内恢复肺功能。

引言

特发性肺纤维化（IPF）是一种不可逆的纤维化疾病，其特征是在肺泡上皮细胞反复损伤后出现异常修复反应，并且成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[1]、[2]、[3]。目前的治疗方法（如尼达尼布、吡非尼酮）只能减缓疾病进展，无法逆转或停止病情，且具有显著的副作用[4]。最近的研究焦点集中在IPF的细胞衰老机制上，特别是衰老的II型肺泡上皮细胞（SAEC II），这些细胞会促进成纤维细胞的分化并持续引发组织重塑[1]。因此，选择性地清除SAEC II被认为是一种有前景的抗纤维化策略。已有多种方法被报道，包括使用细胞衰老药物、经过工程改造的间充质干细胞衍生的细胞外 vesicles（靶向CD38），以及CRISPR-Cas9基因编辑技术[5]、[6]、[7]。然而，大多数现有策略都依赖于单一机制的干预，缺乏针对SAEC II的特异性靶向成分，并且尚未优化以克服肺部密集的纤维化屏障。

利用线粒体的脆弱性：钙过载会诱发细胞凋亡，但简单的钙过载可以通过细胞内的稳态机制得到缓冲。Protoni等人最近的研究表明，衰老细胞依赖于环孢素D（CypD）介导的线粒体通透性转变孔（mPTP）的瞬时开放作为安全机制来排出多余的线粒体Ca²⁺，而抑制这一适应机制会导致有毒的Ca²⁺积累并引发细胞衰老[8]。研究表明，同时削弱线粒体的稳定性会产生协同的致死效应。Narala等人证明，在高氧条件下，A-激酶锚定蛋白1（AKAP1）的删除会导致II型肺泡上皮细胞线粒体异常和层状结构破坏，这突显了AKAP1在肺部线粒体完整性中的关键调控作用[9]。因此，将钙过载与AKAP1沉默相结合可能构成一种协同策略，虽然这种策略在增强SAEC II的细胞凋亡方面尚未得到充分关注。

为了实现AKAP1的表达下调，基因沉默策略提供了一个有前景的方法。其中，DNA酶是一种能够高效特异性切割目标信使RNA（mRNA）的催化核酸，从而提供持续的基因抑制效果[10]。然而，它们的活性通常需要二价金属离子（如Mg²⁺、Mn²⁺）作为辅因子，而且这些离子的浓度需要高于细胞内的水平，并且在系统递送过程中容易受到核酸酶的降解[11]。因此，理想的递送系统必须保护DNA酶并为其提供所需的金属辅因子。在这方面，碳酸钙（CaCO₃）纳米颗粒因其生物相容性、可降解性和酸响应性而受到关注[12]。在酸性的溶酶体环境中，CaCO₃分解，释放出高浓度的Ca²⁺，同时释放出负载的治疗分子（如姜黄素[CUR][13]、[14]。CUR通过配位与Mn²⁺形成稳定的复合物，将CUR的功能（内质网钙释放/外排抑制）与Mn²⁺作为DNA酶辅因子和caspase-8激活剂的双重角色结合起来[15]。据我们所知，之前尚未有研究报告过将CUR、Mn²⁺和针对AKAP1的DNA酶同时加载到酸响应性CaCO₃核心中，以实现时空协调的释放[16]、[17]。

为了进一步赋予这一多功能纳米平台循环稳定性和针对SAEC II的特异性，采用了仿生脂质体包裹技术[18]。脂质双层能够保护封装的DNA酶免受降解，并促进其进入内体。此外，脂质体作为柔软、可变形的载体，能够承受雾化过程中的剪切力，并有效沉积在肺部深处，使其成为成熟的可吸入药物递送系统[19]、[20]。对于靶向细胞的递送，通过SELEX技术获得的DNA适配体具有高特异性[21]、[22]、[23]。对于衰老细胞，L1细胞粘附分子（L1CAM）被确定为表面标记物，Xia等人开发了一种针对L1CAM的适配体，该适配体可在骨关节炎滑膜细胞中诱导细胞凋亡[24]。L1CAM在TGF-β1诱导的肺纤维化中表达升高，并通过miR-150-5p/L1CAM轴驱动成纤维细胞的激活[25]、[26]。因此，开发这样的智能响应性递送系统在精准清除衰老细胞方面具有巨大潜力。

在这里，我们首次结合了AKAP1沉默和线粒体钙过载的作用，并利用Mn²⁺作为DNA酶辅因子和caspase-8激活剂的双重作用，构建了一种基于协同治疗机制的多功能纳米组装体（CCMD@Lipo-Apt），该机制整合了钙过载诱导、线粒体功能调节和凋亡信号放大。该系统以碳酸钙纳米颗粒为核心，其中装载了CUR和锰离子，同时静电吸附了针对AKAP1的DNA酶，这些成分被封装在含有L1CAM适配体的脂质体膜中。衰老细胞通过博莱霉素处理诱导，博莱霉素可诱导DNA双链断裂，从而引发肺泡上皮细胞衰老、成纤维细胞激活和基质沉积，再现了IPF的关键病理过程。在适配体介导的内吞作用后，溶酶体的酸性环境触发CaCO₃分解，释放出钙离子、Mn²⁺、CUR和DNA酶。外源性的Ca²⁺直接提高细胞质内的钙浓度，而CUR则刺激内质网钙释放并抑制外排，从而协同诱导线粒体钙过载、膜电位崩溃和caspase-3依赖的细胞凋亡。同时，释放的Mn²⁺激活AKAP1 DNA酶，下调AKAP1的表达并使线粒体对钙过载更加敏感。Mn²⁺还激活caspase-8，增强死亡受体介导的凋亡信号并强化线粒体途径。这种多机制策略结合了物理化学钙过载、基因AKAP1沉默和Mn²⁺介导的caspase-8激活，通过三条不同的途径作用于SAEC II，从而有效诱导细胞凋亡，为肺纤维化中清除衰老细胞提供了新的方法。

章节片段

材料

氯化钙二水合物（CaCl₂·2H₂O）、氯化锰、DSPC、胆固醇、氯仿、二甲基亚砜（DMSO）、乙醇和CUR均从上海阿拉丁生化科技有限公司（中国）购买。博莱霉素和DSPE-PEG2000从MCE（美国）购买。2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇（Tris）从广州赛国生物科技有限公司（中国）购买。所有寡核苷酸均由 Sangon Biotech Co., Ltd.（中国）定制设计和合成。

仪器

形态学和...

我们首先通过一步气相扩散法合成了碳酸钙（CaCO₃）纳米颗粒，在合成过程中同时装载了CUR和CUR-Mn复合物（CUR-Mn）。TEM图像显示CaCO₃纳米颗粒呈现均匀的球形形态（图1A），而装载了CUR-Mn复合物后的CCM纳米颗粒保持了良好的分散性和形态（图1B）。随后，通过简单孵育将AKAP1 DNA酶加载到CCM上，形成了CCMD

结论

总之，我们开发了一种集成纳米平台CCMD@Lipo-Apt，该平台结合了靶向递送、基因沉默和细胞凋亡诱导，用于治疗肺纤维化。脂质体包裹确保了系统的生物相容性，这种柔软的材料也非常适合雾化吸入；同时，通过L1CAM适配体实现了对衰老细胞的特异性靶向，有效解决了非特异性分布和脱靶效应的问题

Zhuang Chengkai：研究工作。Chen Ting：研究工作。Lin Xiahui：写作——审阅与编辑、监督、资金获取。Hong Shanni：写作——审阅与编辑、监督、资源获取。Wu Jiaqiong：研究工作。Li Xiao：可视化分析。Zhang Dongdong：研究工作。Meng Qingao：验证。Pan Jianqiong：写作——初稿撰写、方法学设计、研究工作、数据管理、概念构思。Teng Liuqin：研究工作、正式分析。

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的实验结果。

我们衷心感谢福建省科技创新联合基金（编号2025Y9489、2023Y9273）、福建省自然科学基金（编号2026J001726、2026J001724）以及福建医科大学科研启动基金（编号XRCZX2020026）的支持。

Jianqiong Pan|Liuqin Teng|Jiaqiong Wu|Xiao Li|Dongdong Zhang|Qingao Meng|Chengkai Zhuang|Ting Chen|Xiahui Lin|Shanni Hong