《Current Research in Food Science》：Pilot-scale Ultraviolet-C and Nano-second Pulsed Electric Field Processing of Milk: Microbial Inactivation and Preservation of Serum Proteins
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中文摘要翻译：
非热加工方法因其保留热敏性成分的潜力，正日益成为牛奶热处理加工的替代方案。在本研究中，研究人员采用中试规模的紫外线-C（UVC）和纳秒脉冲电场（nanoPEF）设备（而非实验室规模仪器）处理牛奶，评估了这两种非热加工方法对微生物削减和牛奶血清
中文摘要翻译：
非热加工方法因其保留热敏性成分的潜力，正日益成为牛奶热处理加工的替代方案。在本研究中，研究人员采用中试规模的紫外线-C（UVC）和纳秒脉冲电场（nanoPEF）设备（而非实验室规模仪器）处理牛奶，评估了这两种非热加工方法对微生物削减和牛奶血清蛋白的影响。牛奶样品分别经UVC照射（0.384–4.8 kJ/L）、nanoPEF（29–182 kJ/L）和高温巴氏杀菌（85 °C，5 min）处理后制备牛奶血清。采用DUMAS法、SDS-PAGE和基于无标记LC-MS/MS的蛋白质组学分析天然血清蛋白谱。通过测定蛋白质表面疏水性、巯基数量、可用游离氨基和羰基含量以及N-甲酰犬尿氨酸水平，评估结构变化和氧化修饰。在UVC剂量高于1.44 kJ/L及nanoPEF能量高于29 kJ/L并辅以50 °C温和加热的条件下，所测微生物指示菌群（包括需氧嗜温菌、耐热菌和大肠菌群）的削减程度与本研究中的高强度巴氏杀菌处理相当。同时，UVC和nanoPEF分别保留了超过88%和95%的牛奶血清蛋白，而热处理牛奶中仅保留56%。非热处理的牛奶血清蛋白结构变化和氧化水平极低，表明其相较于加热处理具有更好的保留效果，与生乳高度相似。仍需进一步的病原菌挑战试验以验证工业相关条件下的微生物安全性。综上，这两种非热技术展现出乳制品热加工的替代潜力，可使产品特性更接近生乳。
**论文解读：中试规模UVC与纳秒脉冲电场处理对牛奶微生物灭活及血清蛋白保留的影响**
**一、研究背景**
牛奶是人类饮食中重要的蛋白质和微量营养素来源，其血清蛋白组分包含多种具有生物活性的蛋白质，在免疫系统发育和抗菌防御等方面发挥关键作用。流行病学研究表明，生乳消费与过敏性疾病的保护效应存在关联，这主要归因于生乳中具有抗过敏和抑菌能力的血清蛋白及肽类。然而，由于生乳可能携带病原微生物，政府机构不鼓励直接饮用。传统热处理虽能确保微生物安全，但乳清蛋白对热敏感，加热过程会导致免疫活性蛋白变性、聚集和糖基化，从而丧失生乳原有的抗过敏和抑菌能力。研究表明，低温巴氏杀菌（72 °C 20 s）后约20%的血清蛋白损失，而UHT处理（142 °C 5 s）和煮沸（100 °C 30 s）的损失率分别约为45%和50%。Holder巴氏杀菌（63 °C 30 min）可使50%的乳铁蛋白和20%的IgG变性。因此，开发既能有效灭活微生物又能保留热敏性蛋白的新型加工技术具有重要的实际意义。
**二、研究目的与意义**
紫外线-C（UVC，波长200–280 nm）通过诱导DNA光产物使微生物无法复制而发挥杀菌作用；纳秒脉冲电场（nanoPEF）则通过超短时（1–100 ns）高强度电场对细胞膜产生不可逆的纳米孔损伤和胞内效应，可有效灭活包括细菌孢子、酵母和某些病毒在内的耐药微生物。尽管已有研究证明连续流或中试规模UVC和PEF处理牛奶的可行性，但这些研究主要集中于微生物灭活和设备性能评估，将UVC和nanoPEF从实验室规模向中试规模转化、同时关联微生物性能与蛋白质组-wide蛋白保留、结构变化和氧化修饰的研究仍较缺乏。本研究假设：在UVC和nanoPEF条件下实现与本研究中高强度热巴氏杀菌参照相当的微生物削减时，牛奶血清蛋白的结构和谱型将更接近生乳。该研究在中试工厂规模评估了不同强度的UVC和nanoPEF与高强度巴氏杀菌对天然微生物、牛奶血清蛋白组组成及蛋白质结构和氧化的影响。该论文发表在《Current Research in Food Science》。
**三、研究的主要技术方法**
本研究使用两个独立批次的荷兰牛乳样品：一批用于UVC处理及其未处理对照（经FrieslandCampina获取并在其试验工厂加工），另一批用于nanoPEF处理及其对照（由PEF Technologies从当地奶牛场采购并在其设施中加工）。高温巴氏杀菌样品与UVC处理样品来自同一批次。UVC处理采用Lyras公司设计的双通道UVC系统（低压汞灯220 W，254 nm波长输出占38%，配备UVC带通滤光片），流速400 L/h，处理条件包括UV80（0.384 kJ/L）、UV300（1.44 kJ/L）、UV500（2.4 kJ/L）和UV1000（4.8 kJ/L）。nanoPEF处理采用PEF Technologies B.V.设计的连续流处理室（平行板电极，间隙0.3 cm），施加150–160 ns指数衰减单极脉冲，电场强度60–65 kV/cm，频率60 Hz，处理条件涵盖能量密度29–182 kJ/L（P1–P4）。牛奶血清通过酸化（pH 4.6）和超速离心制备。主要分析方法包括：DUMAS法测定天然蛋白含量、还原和非还原SDS-PAGE分析蛋白组成和聚集、基于FASP酶解和LC-MS/MS的无标记定量蛋白质组学（Orbitrap Exploris 480，MaxQuant定量，FDR<0.01）、表面疏水性测定（ANS荧光探针）、巯基含量测定（DTNB法）、游离氨基含量测定（OPA法）、蛋白结合羰基含量测定（DNPH法）以及荧光氧化产物（NFK和二酪氨酸）含量测定。统计分析采用单因素方差分析和Tukey's HSD事后检验（p<0.05）。
**四、研究结果**
**4.1 微生物削减**
高强度巴氏杀菌（85 °C 5 min，简称85_5）使需氧嗜温菌和耐热菌分别显著减少3.0-log和1.8-log（p<0.05）。UV80和nanoPEF P1处理虽显著降低原料乳总菌数（p<0.05），但效果低于85_5热处理。UV300、P2和P3处理使需氧嗜温菌和耐热菌分别减少约3-log和1.8-log，与85_5处理相当（p≥0.05）。UV500、UV1000和P4处理在更高强度下获得优于85_5的削减效果（p<0.05），尤其是耐热菌。大肠菌群在所有处理条件下均降至不可检出水平。UVC和nanoPEF的微生物灭活与其已知原理一致（UVC光化学DNA损伤；nanoPEF膜电穿孔），且处理过程中温度升高有限，表明其微生物削减并非主要由整体加热驱动。
**4.2 天然牛奶血清蛋白含量与SDS-PAGE谱型**
85_5样品中牛奶血清蛋白含量从7.1 mg/mL显著降至4.01 mg/mL（p<0.05），即约56%的天然蛋白保留在血清中。低剂量UVC（UV80和UV300）及所有nanoPEF条件下，天然血清蛋白含量与未处理乳无显著差异。UV500和UV1000样品中天然血清蛋白含量显著下降约12%（p<0.05），表明高强度UVC处理可能引起有限蛋白变性。还原和非还原SDS-PAGE显示，UVC和nanoPEF处理样品中主要血清蛋白条带保持可见且强度随处理强度增加仅略有下降；而热处理样品中仅少量BSA、α-La和β-Lg残留。UV1000和P4样品中蛋白条带变淡并出现聚集条带。对脱脂乳的非还原SDS-PAGE分析表明，热处理促进了κ-酪蛋白与乳清蛋白之间的二硫键介导聚集，而UVC和nanoPEF处理仅在最强度条件下观察到少量蛋白聚集。
**4.3 牛奶血清蛋白结构变化**
表面疏水性测定显示，UVC和nanoPEF处理未诱导显著变化（p>0.05），即使最强度条件（UV1000和P4）也仅使疏水性分别增加11.2%和12.4%，表明蛋白展开程度极为有限。相比之下，85 °C加热5 min后表面疏水性显著下降30.6%（p<0.05），归因于热诱导蛋白展开后疏水位点过度暴露并促进分子间共价结合和聚集。巯基含量方面，85_5样品的可及和总巯基水平均显著下降（p<0.05），表明巯基暴露后进一步氧化或转化为分子间二硫键。UVC和nanoPEF样品中可及巯基略有增加而总巯基略有下降，但均不显著。游离氨基含量在所有处理中均无显著变化（p>0.05），表明肽键断裂未发生。
**4.4 牛奶血清蛋白氧化**
85_5样品中蛋白结合羰基含量急剧增加，约为UVC和nanoPEF处理样品的2.5倍。UV500及以上强度UVC处理使羰基含量显著增加（p<0.05），可能与芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的直接光化学氧化有关。nanoPEF处理样品中羰基含量无显著变化。二酪氨酸和NFK水平在UV500和UV1000处理后显著增加（p<0.05），达到与85_5样品相似的水平；nanoPEF处理样品中这两种氧化标志物保持不变。
**4.5 牛奶血清蛋白质组学**
主成分分析（PCA）显示，85_5样品沿PC1（分别解释60.2%和62.8%的总变异）与所有UVC和nanoPEF处理样品明显分离。UVC处理组与生乳之间无分离，表明UVC未显著改变血清蛋白整体组成。P4样品沿PC2（解释11.7%变异）与未处理对照分离，提示电场暴露时间比伴随的温度升高对血清蛋白组成影响更大。P4与P0比较发现3个上调和5个下调蛋白，这些蛋白主要来自血浆或细胞相关蛋白（而非主要乳清蛋白）。在UVC处理乳中检出超过140种天然血清蛋白，nanoPEF处理乳中检出超过120种，而热处理样品中仅约40种蛋白可检出。UVC和nanoPEF处理样品中免疫相关蛋白的丰度变化较小，而热处理的缺失/减少蛋白主要涉及免疫防御和抗菌反应（包括补体/凝血相关过程和LBP、CD14等脂多糖识别蛋白）。
**五、讨论与结论**
**讨论总结：** 本研究使用高强度巴氏杀菌（85 °C 5 min）作为广泛热诱导蛋白变性和聚集的参照。相比之下，HTST（72 °C 15 s）是工业相关的基准，可能导致更有限的热损伤，但热敏性生物活性蛋白（乳铁蛋白、免疫球蛋白、乳过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶）仍可能受影响，因此未来研究应纳入HTST等多种强度的热处理进行更全面比较。实际工业实施需考虑：靶向病原菌挑战试验或替代物验证（食品安全的监管等效性要求）、不同地区的法规和标签要求（如欧盟将UV处理乳视为新型食品）、能源效率（UVC可能具有节能优势，但nanoPEF的能源表现高度依赖系统配置和操作条件）、以及高剂量UVC诱导的蛋白氧化可能对风味和保质期产生的影响。
**结论翻译：** 工业规模UVC照射（0.384–4.8 kJ/L）和纳秒脉冲电场（nanoPEF，29–182 kJ/L）处理成功应用于牛奶并降低了天然微生物数量。同时，温和UVC和nanoPEF分别保留了超过88%和95%的天然牛奶血清蛋白，而85 °C加热5 min的牛奶仅保留56%。此外，UVC和nanoPEF处理未观察到显著结构变化，表明这些方法未诱导明显的蛋白展开或聚集。尽管高强度UVC暴露（>2.4 kJ/L）导致蛋白氧化产物略有增加，但仍远低于热处理样品。总体而言，本研究证明了UVC和nanoPEF作为非热加工方法的潜力，可在降低微生物数量的同时，相较于本研究使用的高强度热处理更好地保留牛奶血清蛋白结构，为未来工业牛奶加工中UVC和nanoPEF工艺的优化提供了基础。
