表没食子儿茶素-3-没食子酸酯与肌红蛋白的结合减弱了血红素释放和脂质过氧化：抗氧化机制的新见解

《Current Research in Food Science》：Binding of epigallocatechin-3-gallate to myoglobin attenuated hemin release and lipid peroxidation: New insight into the antioxidant mechanism

　　

摘要：肌红蛋白（Mb）是肌肉基食品中脂质过氧化的有效诱导剂，蛋白质-黄酮类化合物的结合已被广泛报道。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG，绿茶中主要的黄酮类化合物）与Mb之间的相互作用对脂质过氧化的影响鲜有探索。本工作通过实验和理论方法系统研究了EGCG与Mb之间的相互作用，以阐明EGCG调节Mb氧化还原行为及稳定性的结构机制。EGCG通过静态猝灭机制结合到中央空腔形成Mb-EGCG复合物，疏水力在它们的相互作用中起主导作用。从血红素蛋白中释放的游离血红素（而非无机铁）对Mb介导的脂质过氧化起主要贡献，EGCG明显减弱了脂质体或肌肉中Mb诱导的脂质过氧化。EGCG的抑制机制可能归因于EGCG的结合能促进血红素蛋白的紧密度并缩小血红素基团周围的缝隙，从而导致高铁（met-）Mb的减少和游离血红素释放的抑制。与其对Mb氧化还原状态和稳定性的影响一致，EGCG在储存期间有效保持了血红素蛋白和肉类的红色。因此，研究人员关于EGCG与氧化还原活性Mb相互作用的结果为EGCG的抗氧化机制提供了新见解，并有利于天然黄酮类化合物在含相应血红素蛋白食品的良好品质和新鲜度中的潜在应用。

**研究背景与问题**
在肉类加工和储存过程中，肌红蛋白（myoglobin, Mb）是导致脂质过氧化和色泽劣变的关键促氧化因子。Mb作为单体血红素蛋白，其高铁（met-）状态易释放游离血红素（hemin），后者嵌入细胞膜磷脂双分子层，分解脂质氢过氧化物为烷氧基/过氧自由基，引发脂质过氧化链式反应，造成肉制品褪色、风味劣变和营养损失。传统合成抗氧化剂（如特丁基对苯二酚）存在安全隐患，因此天然多酚（如绿茶中的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，epigallocatechin-3-gallate, EGCG）作为替代物备受关注。尽管已知EGCG可通过金属螯合和自由基清除发挥抗氧化作用，但其与Mb的相互作用如何影响血红素释放和脂质过氧化的分子机制尚不明确。本研究旨在通过实验与理论方法阐明EGCG结合Mb的结构机制，揭示其对Mb氧化还原状态、血红素稳定性及促氧化活性的调控规律，为天然黄酮在含血红素蛋白食品保鲜中的应用提供理论依据。该论文发表于《Current Research in Food Science》。

**关键技术与方法**
研究人员采用荧光光谱（静态猝灭、时间分辨荧光、荧光共振能量转移）、紫外-可见吸收光谱（UV-vis）、圆二色谱（CD）和疏水探针（ANS）置换实验等实验手段，结合分子对接（AutoDock）和分子动力学模拟（Gromacs，100 ns）等理论方法，系统分析了EGCG与Mb的结合模式及构象变化。脂质过氧化模型采用新鲜制备的脂质体和鳕鱼肌肉，通过硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定评估EGCG的抑制效果。颜色稳定性通过色差计测量牛肉和Mb溶液的L*、a*、b*值。

**研究结果**
**3.1 Mb与EGCG相互作用的分子机制**
**3.1.1 Mb-EGCG复合物的荧光光谱**
通过Stern-Volmer方程和荧光寿命测定，研究人员发现EGCG对Mb的荧光猝灭为静态猝灭（k_q > 2×10¹⁰ M^-1s^-1），形成Mb-EGCG复合物。结合常数（K）在298 K时为0.17×10⁴ M^-1，结合位点数n≈1。热力学参数（ΔH>0，ΔS>0，ΔG<0）表明疏水力是主要驱动力，反应自发进行。疏水探针ANS置换实验进一步证实EGCG与Mb的疏水区域结合。FRET计算显示供体（Mb）与受体（EGCG）结合距离r<7 nm，存在非辐射能量转移。

**3.1.2 Mb-EGCG复合物的计算模拟**
分子对接显示EGCG结合于Mb活性中心（heme附近），与疏水残基（LEU89、PRO88、ALA84、ILE75、ALA71）相互作用，并与THR70形成氢键，结合自由能-6.9 kcal/mol。分子动力学模拟（100 ns）表明，Mb-EGCG复合物的均方根偏差（RMSD）稳定，回转半径（Rg）较游离Mb降低，均方根波动（RMSF）减小，平均氢键数约2.84，提示EGCG结合增强了Mb的结构紧密度和稳定性。

**3.1.3 EGCG对Mb构象变化的影响**
同步荧光光谱显示，EGCG使色氨酸（Trp）残基的微环境疏水性降低（最大发射波长红移341→343 nm），酪氨酸（Tyr）微环境无显著变化。三维荧光光谱中峰1和峰2强度下降，证实芳香残基及多肽骨架构象改变。CD光谱显示α-螺旋含量从66.3%降至60.4%，表明EGCG引起Mb二级结构扰动。

**3.2 EGCG对Mb氧化还原状态的影响**
UV-vis光谱显示，EGCG处理4 h后，met-Mb比例从92.2%降至81.6%，而oxy-Mb和deoxy-Mb分别从3.8%和4.0%升至10.5%和7.9%，表明EGCG将高铁Mb还原为还原态（亚铁形式）。Fe³⁺还原力实验证实EGCG具有强还原能力。

**3.3 EGCG对Mb游离血红素释放的影响**
游离血红素测定显示，EGCG（12 μM）处理4 h后，游离血红素浓度从0.522 μM降至0.381 μM，且在0-24 h储存期内持续抑制释放。低浓度EGCG（5 μM）抑制血红素释放，而高浓度（50 μM）反而促进释放，提示适宜浓度的重要性。机制上，EGCG通过缩小heme周围缝隙、增加heme亲和力，减少met-Mb生成从而抑制血红素释放。

**3.4 EGCG对Mb诱导脂质过氧化的影响**
脂质体模型中，游离血红素（而非无机铁Fe³⁺）是引发脂质过氧化的主要因子，EDTA（铁螯合剂）对Mb诱导的脂质过氧化无影响，证实游离无机铁贡献甚微。EGCG预处理的Mb（Mb-EGCG混合物）显著抑制脂质体和鳕鱼肌肉中TBARS生成。颜色稳定性实验表明，EGCG处理可维持Mb和牛肉的红色（a*值升高），延缓褪色。

**3.5 EGCG的抗氧化能力**
EGCG以剂量依赖方式清除ABTS自由基（20 μM时清除率51.3%），并通过EPR检测证实其直接清除·OH的能力。研究人员提出两步抗氧化机制：早期通过还原met-Mb和抑制血红素释放阻断脂质自由基生成；后期通过直接清除烷氧基/过氧自由基抑制脂质过氧化链式反应。

**3.6 EGCG与血红蛋白（Hb）的结合同样抑制血红素释放和脂质过氧化**
EGCG同样通过静态猝灭与Hb结合，减少met-Hb状态，抑制游离血红素释放，并抑制Hb催化的脂质过氧化。该结果提示EGCG对多种血红素蛋白具有类似调控作用，并为绿茶消费与心血管疾病风险降低之间的关联提供分子解释。

**讨论与结论**
本研究通过实验与理论结合，系统揭示了EGCG与Mb的相互作用机制：EGCG以疏水力为主导结合于Mb中央空腔，增强蛋白结构紧密度，缩小heme缝隙，从而减少met-Mb生成并抑制游离血红素释放，进而减弱Mb诱导的脂质过氧化。这一机制不同于经典的金属螯合和自由基清除，为天然黄酮的抗氧化作用提供了新视角。研究结论：EGCG通过结合Mb，有效抑制血红素释放和脂质过氧化，有利于维持含血红素蛋白食品（如肉类、血制品）的新鲜度和品质。但存在局限性，如其他食品组分（盐、磷脂酶A₂、游离脂肪酸等）可能干扰EGCG-Mb相互作用及后续脂质过氧化，且不同物种（鱼、牛等）的Mb血红素亲和力及释放动力学存在差异，需进一步研究以指导实际应用。