lncRNA-LOC680225在氟诱导神经毒性中的调控作用：对miR-194–5p/Slc5a7信号轴的见解

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：The regulatory role of lncRNA-LOC680225 in fluoride-induced neurotoxicity: Insights into the miR-194–5p/Slc5a7 signaling axis

　　

研究人员前期的流行病学研究表明，低至中度氟暴露可诱导儿童胆碱能功能障碍，但其潜在机制仍不清楚。在此，研究人员对氟暴露大鼠海马组织进行转录组测序，鉴定出溶质载体家族5成员7（Slc5a7，编码胆碱转运蛋白1（Cht1））、长链非编码RNA（lncRNA）LOC680225和微小RNA（miRNA）miR-194–5p的表达改变。体内和体外实验证实，氟可破坏胆碱能系统和突触可塑性，降低乙酰胆碱（ACh）含量，下调Slc5a7、胆碱乙酰转移酶（ChAT）、突触后密度蛋白-95（PSD-95）和突触素-1，并增加乙酰胆碱酯酶（AChE）表达。氟还抑制大鼠海马和PC12细胞中的LOC680225，同时升高miR-194–5p。LOC680225过表达或miR-194–5p抑制可部分挽救氟介导的Cht1减少、神经元凋亡和细胞活力丧失，而miR-194–5p过表达则加重细胞损伤。荧光素酶实验验证了LOC680225和Slc5a7是miR-194–5p的直接靶标。总之，研究人员的发现支持一个潜在的ceRNA调控网络，其中LOC680225海绵吸附miR-194–5p以调节Slc5a7表达。LOC680225/miR-194–5p/Slc5a7信号轴是氟诱导神经毒性中的一个关键调控通路，而非唯一机制，为氟介导的胆碱能和突触功能障碍的分子基础提供了新见解。

研究背景：氟是化学性质活泼的卤族元素，过量氟暴露除导致氟斑牙和氟骨症外，还可穿透血脑屏障引起不可逆的发育神经毒性。流行病学证据已将氟暴露与儿童智商降低、内化行为增加及注意缺陷多动障碍患病率升高相关联，但氟诱导神经毒性的确切分子机制仍未阐明。乙酰胆碱（ACh）是中枢神经系统重要的神经递质，其合成、释放和水解受胆碱乙酰转移酶（ChAT）、胆碱转运蛋白（Cht1）和乙酰胆碱酯酶（AChE）等关键蛋白调控。已有证据表明氟暴露可损伤突触并干扰神经传递，但Slc5a7（编码Cht1）及胆碱能系统在其中的具体作用尚不清楚。非编码RNA（ncRNA）包括长链非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA），在神经发育和功能中发挥关键作用，但它们在氟神经毒性中的调控网络，尤其是LOC680225、miR-194–5p与Slc5a7之间的相互作用，尚未见报道。为此，研究人员基于前期人群研究线索，利用体内外模型系统探讨了这一信号轴的调控机制。

研究人员开展了全转录组测序，结合大鼠体内染毒和PC12细胞体外处理，确认氟暴露干扰胆碱能系统、损害突触可塑性，并验证了LOC680225/miR-194–5p/Slc5a7构成的竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络。研究证明LOC680225过表达或miR-194–5p抑制可部分挽救氟诱导的Cht1下调、神经元凋亡和细胞活力丧失，而miR-194–5p过表达则加重损伤。双荧光素酶实验证实二者均为miR-194–5p的直接靶标。该成果发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》，为氟诱导胆碱能和突触功能障碍的分子机制提供了新见解。

关键技术方法：采用SPF雌性Sprague-Dawley大鼠（8周龄）随机分为对照组及10、50、100 mg/L NaF饮水染毒组，染毒6个月；PC12细胞以20、40、80 mg/L NaF处理24 h建立体外模型。主要技术包括Morris水迷宫实验、Nissl染色、扫描电镜（SEM）、ELISA、Western blot、RT-qPCR、全长转录组测序（mRNA、lncRNA和miRNA）、荧光原位杂交（FISH）及双荧光素酶报告基因实验。海马测序样本来自对照组和100 mg/L NaF组各3只大鼠。

研究结果：

3.1 NaF暴露损伤雌性大鼠的学习记忆并导致海马神经元丢失：Morris水迷宫空间探索实验显示，50和100 mg/L NaF组大鼠平台穿越次数减少、目标象限停留时间缩短；Nissl染色显示海马神经元排列松散、尼氏体染色变浅，表明NaF损伤学习记忆并降低神经元活力。

3.2 NaF暴露减少PC12细胞突触连接：扫描电镜观察显示，随NaF浓度增加，PC12细胞突触长度缩短、数量减少，神经突碎片化加重，80 mg/L时正常突触连接完全丧失，表明NaF剂量依赖性地破坏突触连接。

3.3 NaF暴露诱发SD大鼠和PC12细胞胆碱能系统功能障碍：转录组测序和KEGG富集分析发现胆碱能突触通路异常，Slc5a7（Cht1）显著下调。Western blot显示NaF组Cht1和ChAT蛋白水平降低，AChE升高；ELISA显示血清及细胞上清中ACh含量降低；同时M₁、M₃毒蕈碱型乙酰胆碱受体及α₇烟碱型乙酰胆碱受体的mRNA水平也下调。表明氟降低ACh合成并促进其水解，导致ACh含量下降，损害胆碱能传递。

3.4 NaF损害PC12细胞突触可塑性并促进过度凋亡：Western blot显示80 mg/L NaF组突触后致密蛋白-95（PSD-95）和突触素-1表达下调，cleaved caspase-3表达上调，表明氟损害突触可塑性并诱导凋亡。

3.5 在NaF暴露雌性大鼠海马中筛选可能与Slc5a7相互作用的lncRNAs和miRNAs：测序分析发现3个上调、13个下调lncRNA，其中LOC680225与Slc5a7共表达系数>0.85；miRNA测序发现42个上调、9个下调miRNA，通过Cytoscape网络预测rno-miR-194–5p和rno-miR-511–3p可同时靶向LOC680225和Slc5a7，因miR-194–5p在人类与大鼠间序列高度同源，故选为后续研究对象。

3.6 Ad-LOC680225介导的LOC680225过表达缓解NaF诱导的PC12细胞Cht1下调：FISH显示LOC680225与Cht1共定位于胞质，NaF处理下二者表达均降低；过表达LOC680225后，NaF处理组Cht1蛋白水平较单独NaF组明显升高，表明LOC680225部分挽救Cht1下调。

3.7 抑制miR-194–5p部分逆转NaF诱导的PC12细胞Cht1下调：NaF上调miR-194–5p表达，FISH显示其表达随NaF浓度升高而增强；miR-194–5p mimic降低Cht1表达并加重NaF的抑制作用，而抑制剂可上调Cht1并部分逆转NaF效应，表明miR-194–5p负性调控Cht1。

3.8 LOC680225和Slc5a7均为miR-194–5p的靶标：双荧光素酶报告实验显示，miR-194–5p mimic显著降低野生型（WT）LOC680225和Slc5a7的荧光素酶活性，而突变型（Mut）组无此效应，证实两者是miR-194–5p的直接靶基因。

3.9 LOC