在欧洲饮食代表性比例下，共存的交链孢菌毒素产生的不可预测的协同遗传毒性效应

《Environmental Pollution》：Unpredicted synergistic genotoxic effects of co-occurring Alternaria mycotoxins at ratios representative of the European diet

　　

**摘要**

链格孢属（*Alternaria*）真菌是污染包括番茄、谷物和油料种子等多种农产品的植物病原真菌。它们同时产生多种真菌毒素，其中最为普遍的是交链孢酚（alternariol, AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether, AME）、细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid, TeA）、交链孢烯（altenuene, ALT）和 tentoxin（TEN）。这些毒素的个体毒理学特性已有充分记录：AOH和AME具有遗传毒性，TeA具有核糖体毒性，而ALT和TEN则表现出低毒性。尽管它们在食品中频繁共存，欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）建立的毒理学关注阈值（Thresholds of Toxicological Concern, TTC）并未考虑其联合效应，而这些联合效应在很大程度上仍未得到探索。本研究首次评估了这五种共存毒素组合在大鼠肠道IEC-6细胞中的遗传毒性效应，所用混合物反映了欧洲膳食中的暴露比例（AOH:AME:TeA:ALT:TEN = 1:1:15:1:1）。AOH:AME混合物表现出协同遗传毒性，尤其是在低浓度下。TeA虽然单独存在时无遗传毒性，但显著放大了AOH和AME诱导的DNA损伤，这与涉及核糖体毒性导致蛋白质合成受损的机制一致。ALT和TEN未显示出内在效应，也未调节混合物的遗传毒性。细胞毒性在AOH:AME混合物中主要表现为加性效应，但在存在TeA时转变为协同效应。总体而言，本研究首次证明共存的链格孢毒素间存在协同相互作用，揭示了无法从单一化合物预测的效应。这些发现强调了将混合物效应纳入风险评估框架的迫切必要性。

**共现链格孢毒素在欧洲膳食代表性比例下未预见的协同遗传毒性效应：研究解读**

**一、研究背景与问题**

链格孢属（*Alternaria*）真菌是重要的植物病原菌，可污染番茄、谷物、油料种子等多种农作物，并在田间及储存期间（尤其低温条件下）侵染作物。链格孢霉菌产生的真菌毒素对人类和动物健康构成威胁。链格孢属真菌能够同时产生多种毒素，其中最常见的是交链孢酚（alternariol, AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether, AME）、细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid, TeA）、交链孢烯（altenuene, ALT）和tentoxin（TEN）。目前，欧盟尚未针对链格孢毒素制定监管法规，主要原因是毒理学数据不足。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）已提出AOH和AME的毒理学关注阈值（Threshold of Toxicological Concern, TTC）为2.5 ng/kg体重/天，TeA为1500 ng/kg体重/天。监测数据表明，欧洲成年人通过膳食摄入AOH和AME可能超过TTC值，婴幼儿对TeA的暴露也可能超过其TTC值。

从毒理学角度看，AOH和AME是研究最深入的链格孢毒素，其细胞毒性和遗传毒性已在多种细胞系（包括肠道、肝脏、胃、肾和肺细胞系）中得到证实，这些效应与其干扰拓扑异构酶活性的能力有关。TeA的细胞毒性被认为与其核糖体毒性活性相关，即通过抑制真核细胞中新合成蛋白质的释放来抑制蛋白质合成，但未观察到其遗传毒性。ALT和TEN的数据有限，现有研究表明它们不表现出显著的细胞毒性或遗传毒性。

鉴于链格孢毒素是同时产生的，仅基于单一化合物的毒性评估是不够的。多种真菌毒素的联合暴露可能产生无法从单一毒理学特征预测的协同、加性或拮抗效应。特别是，遗传毒性链格孢毒素之间潜在的协同相互作用值得进一步研究，TeA的作用值得特别关注，因为其他核糖体毒性真菌毒素（如脱氧雪腐镰刀菌烯醇, deoxynivalenol, DON）已被证明能加剧多种DNA损伤剂的遗传毒性活性。然而，五种主要链格孢毒素的联合效应，尤其是遗传毒性方面，在很大程度上仍未得到探索。

**二、研究内容与主要技术方法**

本研究旨在调查包含多达五种链格孢毒素的不同混合物的毒理学影响，评估其细胞毒性和遗传毒性效应。混合物配方基于EFSA报告的欧洲人群膳食暴露评估数据，设定为反映现实暴露场景的比例（AOH:AME:TeA:ALT:TEN = 1:1:15:1:1）。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：
1. **细胞模型**：使用来自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）的大鼠肠道上皮细胞IEC-6（Intestinal Epithelial Cell 6, IEC6, CRL-1592）作为实验模型。
2. **细胞毒性评估**：采用RealTime-Glo?检测法实时监测细胞活力，并利用Compusyn软件计算半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）值。
3. **遗传毒性评估**：通过In Cell Western法量化磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）水平作为DNA损伤标志物，并使用免疫荧光染色结合共聚焦显微镜量化γ-H2AX焦点（foci）数目。
4. **相互作用分析**：采用Chou和Talalay方法（Combination Index, CI）及Compusyn软件分析毒素间的相互作用类型（协同、加性或拮抗），并计算剂量减少指数（Dose Reduction Index, DRI）。

**三、研究结果**

**1. 混合物中链格孢毒素比例的确定**：基于EFSA的膳食暴露评估数据，欧洲人群对AOH和AME的暴露水平相似，TeA/AOH比值平均约为15。根据这些暴露数据，将组合混合物的比例设定为AOH:AME:TeA:TEN:ALT = 1:1:15:1:1，代表包含ALT和TEN的混合物最坏情况暴露场景。

**2. 细胞毒性结果**：
- **单一毒素的细胞毒性**：AOH和AME表现出最高的细胞毒性效力（AOH > AME），TeA次之，而ALT和TEN表现出低细胞毒性。
- **混合物中的相互作用**：AOH:AME（1:1）组合在24小时处理后的40%-80%细胞毒性水平（对应10:10至30:30 μM）表现为加性相互作用，在低于40%细胞毒性水平（<10:10 μM）时变为拮抗。当TeA与AOH和AME组合形成三元混合物AOH:AME:TeA（1:1:15）时，在24小时处理后的整个浓度范围内均表现出协同相互作用（CI < 0.9）。ALT和TEN的存在未改变三元混合物的相互作用模式。这些结果表明TeA在链格孢毒素混合物中通过放大其联合细胞毒性发挥着关键作用。

**3. 遗传毒性结果**：
- **单一毒素的遗传毒性**：AOH和AME是仅有的具有遗传毒性的化合物，AOH效力高于AME。TeA、TEN和ALT均未显示出遗传毒性活性。在22小时恢复期后未检测到DNA损伤信号，表明DNA链断裂在毒素暴露后得到有效修复。AOH和AME的遗传毒性通过微核的出现得到进一步确认。
- **AOH和AME混合物的协同遗传毒性**：二元混合物AOH:AME（1:1）的相互作用在低浓度下表现为协同效应，但在最高测试浓度（50 μM）时转为拮抗。
- **TeA对遗传毒性的放大作用**：TeA显著增强了AOH、AME及AOH:AME混合物的遗传毒性效力。免疫荧光染色证实，TeA的存在增加了AOH和AME诱导的DNA链断裂水平。值得注意的是，在22小时恢复期后未检测到残留DNA损伤，表明TeA的作用并未损害DNA链断裂的长期修复。
- **DON对遗传毒性的放大作用**：与TeA类似，核糖体毒性真菌毒素DON在低至1 μM的浓度下即可增强AOH和AME的遗传毒性，其增强程度与TeA相当。TeA和DON共有的核糖体毒性特性可能有助于这种效应。
- **ALT和TEN的作用**：ALT和TEN的加入未改变三元混合物AOH:AME:TeA的遗传毒性效应，表明它们不干扰混合物的遗传毒性潜力。

**四、讨论与结论**

本研究首次系统评估了五种主要链格孢毒素以反映欧洲膳食暴露比例组成的混合物的细胞毒性和遗传毒性。研究结果表明，AOH和AME的等摩尔组合可诱导协同遗传毒性反应，这在最低测试浓度下最为显著。这种协同作用可能归因于AOH和AME不同且互补的遗传毒性机制：AOH抑制拓扑异构酶I、IIα和IIβ，而AME选择性抑制拓扑异构酶IIα；此外，AOH还能稳定酶-DNA可切割复合物，作为拓扑异构酶毒物发挥作用。

TeA虽无遗传毒性活性，但具有核糖体毒性，能够显著加剧AOH、AME及其二元混合物的遗传毒性效应。类似现象此前已在另一种核糖体毒性真菌毒素DON中得到描述。DON同样能增强AOH和AME的遗传毒性，但其有效浓度远低于TeA（1 μM DON对比50 μM TeA）。蛋白质合成抑制可能损害DNA修复途径，最终导致DNA链断裂的积累，但这种修复过程的改变应该是可逆的，因为在22小时恢复期后未检测到残留DNA损伤。

考虑到DON和链格孢毒素在食品基质中的共污染已被报道，且儿童和孕妇尿液分析显示他们经常同时暴露于DON和AME，涉及DON和链格孢毒素的联合暴露场景具有毒理学相关性。

研究结论指出，在五种最普遍的链格孢毒素中，只有AOH、AME和TeA在肠道上皮细胞中表现出毒理学特性。它们的混合物的毒性效应无法从单一毒素的毒性准确预测，因为其相互作用可能导致意想不到的结果。非毒性毒素ALT和TEN不影响混合物的总体毒性，而TeA强烈加剧了AOH和AME的遗传毒性效应。此外，AOH和AME的组合诱导了协同遗传毒性效应。鉴于这些毒素的致突变性及其在食品中的共存，有必要在人体肠道细胞模型中研究它们单独及与TeA联合的致癌潜力。这些发现强调了风险评估框架必须考虑共存真菌毒素之间的毒理学相互作用。