海洋酸化重塑食用贻贝外套膜磷酸化蛋白质组并削弱其壳的机械韧性

《Environmental Pollution》：Ocean acidification remodels the mantle phosphoproteome and weakens shell mechanical resilience in Mytilus edulis

　　

摘要

由大气CO?浓度上升驱动的海洋酸化（OA）威胁着钙化海洋生物的结构完整性和生态功能，然而环境酸化与贝壳机械韧性下降之间的机制联系仍未得到充分理解。本研究整合了微结构成像、力学测试和定量磷酸化蛋白质组学，以表征贻贝（Mytilus edulis）对海洋酸化的结构、力学和磷酸化响应，并探究其相互关系。成体贻贝被暴露于近未来pH条件（8.1、7.9、7.7）下长达40天。海洋酸化导致珍珠层方解石平板和棱柱层柱状晶体的渐进性结构紊乱，但未改变文石-方解石的多型态，表明酸化驱动的是结构退化而非矿物学转变。相应地，贝壳的抗压强度呈pH和时间依赖性的下降，在pH 7.7下经40天后约降低60%。磷酸化蛋白质组学分析鉴定出3,720个磷酸化蛋白（10,780个位点），揭示了酸化诱导的磷酸化网络的广泛重构。差异磷酸化肽段对应的蛋白质主要位于细胞核中，并富集于含有激酶域、PH域、PDZ域和RNA识别域的蛋白质。功能分析涉及MAPK信号通路、囊泡转运、离子转运、糖酵解/糖异生、自噬及钙相关过程。磷酸化蛋白质组学重构与贝壳微结构和抗压强度的退化相关，支持了外套膜磷酸化响应与酸化条件下生物矿化受损之间的关联。富集通路和蛋白质域在功能上与钙依赖性信号传导、囊泡转运、细胞骨架组织和细胞代谢相关，为未来机制验证提供了可检验的候选对象。总体而言，这些发现支持了一个工作模型，即海洋酸化伴随着协调的磷酸化重构和贝壳机械韧性的渐进性丧失。我们进一步提出了一个概念验证性的双指标框架，将候选分子哨兵与生物体指标整合，为未来评估渐进性海洋酸化下的养殖业韧性和生态系统脆弱性提供了概念基础。

引言

海洋酸化是指海洋吸收过量大气二氧化碳（CO?），导致海水pH值逐渐下降和碳酸盐化学发生显著扰动的过程。海洋酸化和全球变暖共享一个共同的初级驱动因素：大气CO?浓度的持续上升。作为地球最大的碳汇，海洋目前吸收了约四分之一的 anthropogenic CO? 排放量，从而缓冲了大气浓度的增加，同时加剧了酸化（Doney等，2009；Vargas等，2022；?elekli和Zari?，2024）。模型预测表明，到2100年大气CO?浓度可能达到工业革命前水平的3至4倍，导致海水平均pH值下降0.3至0.5个单位（从8.1降至约7.7；Caldeira和Wickett，2003；Pachauri等，2014）。这一降低将伴随碳酸根离子（CO?2?）可用性的减少，限制了碳酸钙（CaCO?）形成所需的基本底物。因此，双壳类、棘皮动物、珊瑚和钙质浮游生物等钙化类群预计将经历贝壳和骨骼形成受阻、形态畸变和死亡率升高等问题。这些后果不仅带来生态风险，还会对全球渔业和依赖骨骼结构的养殖业造成巨大的经济损失（Feely等，2008；Leung等，2022）。

海洋酸化对生物矿化的影响尤为令人担忧。通过降低CaCO?的饱和状态，酸化海水同时加速了现有骨骼的溶解并阻碍了新钙化的进行，导致贝壳结构脆弱、强度减弱（Goffredo等，2014）。生物矿化是一个高度受调控的过程，在这一过程中，生物体将无机离子有序地沉积为结晶结构，服务于保护、支撑、运动、解毒和定向等多种生物学功能（Weiner和Dove，2003；Shi和Li，2024）。实验研究表明，该过程对pH波动高度敏感。当18个物种（涵盖甲壳类、棘皮动物、软体动物、环节动物以及红藻和绿藻）在酸化条件下培养时，超过一半的物种在60天后净钙化率下降，部分甚至出现净贝壳溶解（Ries等，2009）。类似地，将马氏珠母贝（Pinctada fucata）暴露于pH 7.6的海水中28天，导致珍珠层晶体出现明显畸变（Welladsen，2010）。在分子水平上，外套膜组织的转录组分析显示，酸碱调节和能量代谢相关基因上调，而生物矿化相关基因下调，表明酸化间接抑制了贝壳形成同时加速了溶解（Fabry等，2008；Fitzer等，2014a）。这些效应的生态影响超越了单一物种：贝类生物量的持续减少会破坏底栖栖息地，改变群落结构，并减少可供人类利用的营养资源（Newell，2004）。

面对这些胁迫，软体动物进化出了适应性的贝壳修复和维持机制。骨骼虽然是非细胞的，但表现出显著的塑性，可以在环境胁迫下重塑以增强对捕食、钻孔和物理损伤的抵抗力（Clelland，2000；Cintra-Buenrostro，2007）。贝壳的修复和生长由外套膜组织分泌的有机基质调控，该基质控制CaCO?晶体的成核、多型态选择（文石与方解石）以及微结构组织。骨骼损伤后，外套膜上皮细胞表现出线粒体增殖和囊泡积累，反映了修复过程中升高的代谢和分泌活性（Watabe，1983；Pratiwi等，2024）。基质蛋白在贝壳微结构中呈异质性分布，例如在海洋海胆中定位于纳米级孔洞内，在外骨骼中沿晶体边界分布（Berman等，1990；Robach等，2005）。类似机制也存在于贻贝等双壳类中，其中这些蛋白质引导珍珠层和棱柱层的形成。共聚焦成像进一步显示，珍珠层和棱柱层中这些蛋白质的空间分布直接塑造了晶体形态（Liu等，2015a）。

重要的是，磷酸化等翻译后修饰为贝壳基质蛋白的功能增加了另一层调控。越来越多的证据表明，磷酸化在珍珠贝和其他双壳类的基质蛋白中广泛存在，其调节成核效率、晶体生长和整体贝壳完整性（Tsukamoto等，2004；Suzuki等，2009；Liu等，2015b）。磷酸化已被证明可以改变这些蛋白质在CaCO?沉积中的抑制或促进功能，凸显了其在生物矿化中的核心作用（Bilbrough等，2022）。因此，理解磷酸化如何在环境胁迫下调控基质蛋白功能是阐明变化海洋中钙化分子机制的关键。然而，其在海洋酸化条件下的作用仍未得到充分探索。

从社会经济角度看，这些挑战对中国尤为严峻，因为中国约占全球贝类养殖的85%。贻贝（M. edulis）是最广泛养殖的贻贝物种之一，贡献了全球贻贝总产量的近59%（Vaughn和Hoellein，2018）。除了经济价值外，贻贝还发挥着重要的生态作用，主导着潮间带和潮下带生态系统，这些系统特别容易受到pH驱动的碳酸盐化学波动对CaCO?结构的影响。鉴于贻贝作为研究生物矿化的模式生物和在养殖业中的基石物种的双重重要性，它代表了研究酸化条件下蛋白质磷酸化如何调控贝壳形成和修复的理想体系。

本研究旨在表征海洋酸化条件下贻贝生物矿化响应相关的磷酸化变化。通过整合超微结构成像、力学测试和磷酸化蛋白质组学分析，我们考察了环境酸化、外套膜磷酸化重构与贝壳结构和力学性能之间的关系。我们的发现提供了软体动物对海洋酸化响应的系统级磷酸化蛋白质组学视角，并鉴定了未来功能验证的候选通路。

部分片段

酸化条件下的实验设计与样本采集

采用受控的多级pH暴露系统和分时段采样来研究海洋酸化对贻贝（M. edulis）的影响。设立了三个实验条件：对照组（pH 8.1 ± 0.02），无CO?富集；以及两个酸化处理组（pH 7.9 ± 0.02和pH 7.7 ± 0.02），通过将空气与CO?混合生成。海水pH使用AquaMedic AT控制系统（AquaMedic GmbH，德国）配合AquaMedic pH 2000 pH计算机接收来自……的信号进行控制

酸化条件下珍珠层和棱柱层的超微结构变化

如图1所示，扫描电镜（SEM）分析揭示了贻贝贝壳在酸化海水暴露10天、20天和40天后珍珠层和棱柱层均发生了渐进性的超微结构改变。在对照条件（pH 8.1）下，珍珠层保持规则排列的六边形平板，尺寸相对均匀，而棱柱层由组织良好的柱状晶体组成。相比之下，酸化的贝壳逐渐失去了这些特征性的……

海洋酸化对贝壳微结构和力学性能的影响

我们的结果表明，海洋酸化逐渐损害了贻贝贝壳的结构完整性和机械性能。定量SEM形态学分析显示，珍珠层对酸化尤为敏感，随着pH值降低和暴露时间增加，平板间距、平板宽度和形态正常的六边形平板比例均显著减少。棱柱层表现出不同的响应模式：柱间……

结论

海洋酸化导致贻贝珍珠层和棱柱层贝壳微结构的渐进性退化和抗压强度的显著下降，而底层的文石和方解石多型态保持不变。这些生物体变化伴随着外套膜磷酸化蛋白质组的大规模重构，涉及与信号转导、细胞骨架组织、囊泡转运、自噬和细胞代谢相关的蛋白质和通路。这些……

CRediT作者贡献声明

夏斌：写作–审阅与编辑、经费获取、概念构思。徐冬雪：监督指导、概念构思。周琪：调查研究、数据整理。宋一泽：方法学、数据整理。王菲：监督指导、项目管理。俞广磊：验证、调查研究。杜金哲：写作–原稿撰写、经费获取、数据整理。李欣：项目管理、方法学

未引用参考文献

Cao和Caldeira，2008；Dineshram等，2021；Garcia-Soto等，2021；Lu等，2018；Luan和Wang，2021；Nagelkerken和Connell，2022；Patergnani等，2020；Wang等，2023；Zheng等，2019。

利益冲突声明

? 作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响到本文所报道的工作。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（32503146）、山东省自然科学基金（ZR2022QD147）和中国山东省一流渔业学科项目的资助。

杜金哲 | 李欣 | 周琪 | 宋一泽 | 王菲 | 俞广磊 | 徐冬雪 | 夏斌

青岛农业大学海洋科学与工程学院，山东省青岛市266109，中国