由Komagataella phaffii生产的IgG结合蛋白CBB的遗传毒性、亚慢性毒性和致敏性评估

《Food and Chemical Toxicology》：Genotoxicity, subchronic toxicity, and allergenicity evaluation of IgG Binding Protein CBB produced from Komagataella phaffii

　　

研究人员确认了IgG结合蛋白CBB用于食品的安全性。研究人员开展了两项遗传毒性研究和一项为期13周的口服灌胃毒性研究。未观察到有害作用剂量被确定为614 mg/kg bw/day，这是测试的最高剂量。一项计算机模拟致敏性评估证实其具有较低的交叉反应风险。

在现代西方生活方式中，饮食（如高糖摄入、高度加工食品摄入和低纤维摄入）和异生素（如抗生素或质子泵抑制剂以及食品添加剂）等环境因素在破坏健康肠道微生物群方面发挥重要作用，导致肠道菌群失调。菌群失调常表现为致病共生菌的过度生长，这些细菌是共生肠道微生物群的一部分，但在肠道受损时会引发问题，可能导致感染和炎症性肠病。艰难梭菌就是一种致病共生菌，通常在健康个体中无症状定植。当健康的肠道微生物群被破坏时，艰难梭菌可能会过度繁殖并产生肠毒素导致感染。宿主免疫系统与肠道微生物群之间的双向关系对整体健康至关重要，并且提出了多方面的挑战。目前，越来越需要新的饮食方法来维持肠道健康。当个体面临致病共生菌过度生长的风险时，富含免疫球蛋白的功能性蛋白补充剂可以帮助中和致病共生菌产生的不健康代谢物。基于Phipps et al.之前对IgG结合蛋白LT的研究基础，IgG结合蛋白CBB作为一种互补的功能性食品成分，通过结合高亲和力功能表位并阻断参与艰难梭菌分泌的TcdB毒素介导的肠道破坏的结构域，促进TcdB的安全排泄，有助于维持肠道稳态。IgG结合蛋白CBB模拟类驼源IgG片段，并通过精准发酵由生物工程的Komagataella phaffii（简称K. phaffii，原名Pichia pastoris）生产，该菌株具有合格安全假定地位。为了确保其作为新型人类肠道稳定成分的安全性，研究人员开展了全面的毒理学、潜在致敏性和适用性评估，该研究发表在《Food and Chemical Toxicology》上。

研究人员采用了多种关键技术方法进行安全性评估。首先，按照联合国粮农组织/世界卫生组织和食品法典的指导原则，通过序列同源性搜索进行计算机模拟致敏性评估，使用了AllergenOnline数据库、Allermatch数据库以及AllerCatPro 2.0搜索工具。其次，开展了体外遗传毒性试验，包括遵循经济合作与发展组织试验指南471的细菌回复突变试验（使用“处理和洗涤”程序）和遵循OECD TG 487的体外哺乳动物细胞微核试验。最后，在符合良好实验室规范的条件下，使用了由Charles River Laboratories提供的Wistar Han大鼠样本队列，开展了14天剂量范围寻找研究和13周口服灌胃重复剂量毒性研究，并在13周研究后包含4周的恢复期。所有研究的浓度和剂量均基于特定的IgG结合蛋白CBB含量进行了校正。

在研究结果部分，各小标题及结论如下：

3.1. In silico allergenicity assessment
通过使用AllerCatPro 2.0搜索工具、AllergenOnline数据库以及Allermatch数据库进行序列同源性搜索。结果表明，IgG结合蛋白CBB的致敏性结果为“无证据”。在与AllergenOnline数据库的80个氨基酸滑动窗口比对中，发现了一项与玉米几丁质酶的匹配，但其全长序列的同源性百分比低于50%，E值为0.00023。根据评估标准，只有当匹配的E值小于1 x 10^-7且全长序列同源性大于50%时，才会被进一步评估。由于玉米并非主要过敏原来源，且几丁质酶只是次要的玉米过敏原，因此该匹配不被认为具有致敏性隐患。未发现其他匹配。结论为IgG结合蛋白CBB不太可能带来致敏性和交叉反应的风险。

3.2. Genotoxicity studies
3.2.1. Bacterial reverse mutation test (Ames test)
通过在存在和不存在S9代谢激活的情况下对鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98、TA100、TA1535和TA1537以及大肠杆菌色氨酸依赖菌株WP2 uvrA pKM101进行细菌回复突变试验。结果显示，在最高测试浓度12820 μg/mL下，IgG结合蛋白CBB未引起回复突变菌落数的显著增加，且阳性对照组出现了显著增加，阴性对照在历史数据范围内。结论为IgG结合蛋白CBB在存在和不存在代谢激活的情况下均无致突变性。

3.2.2. In vitro mammalian cell micronucleus test
通过在存在和不存在S9代谢激活的情况下对人类外周血淋巴细胞进行短期和连续暴露的体外哺乳动物细胞微核试验。结果显示，在所有处理培养物中，微核双核细胞的平均频率与阴性对照组相比无统计学差异（p≤0.05），且在历史阴性对照范围内。结论为IgG结合蛋白CBB不具有致裂变或非整倍体诱变性。

3.3. Repeated-dose 14-day oral gavage dose-range finding study in rats
通过向Wistar Han大鼠灌胃给予77、307和614 mg/kg bw/day的IgG结合蛋白CBB共14天。用于血液学分析的样本收集在含有抗凝剂K₂ EDTA的采血管中。观察到高剂量组雄性大鼠体重变化略有下降，但属于微小且具有性别特异性。一些血液学指标和临床化学指标出现统计学显著变化，但变化轻微、在历史对照范围内、性别特异性或缺乏剂量-效应关系，且未发现与受试物相关的肉眼病理发现。结论为该受试物的未观察到有害作用剂量为614 mg/kg bw/day。

3.4. Repeated-dose 13-week oral gavage study in rats
3.4.1. Mortality and clinical observations
通过为期13周的灌胃研究，未发生与受试物相关的死亡，也未观察到与受试物相关的临床体征、眼科异常或功能观察组合测试性能变化。部分运动活动的统计学差异被认为是正常生物变异，缺乏剂量-效应关系。结论为该受试物在13周内未引起明显的临床毒性。

3.4.2. Body weight and food consumption
通过在整个给药期间对体重和食物消耗的监测，结果显示各组间平均体重增加或食物消耗无统计学显著差异。结论为该受试物对大鼠的生长和进食无明显不良影响。

3.4.3. Clinical pathology
通过对血液学、凝血、临床化学和甲状腺激素等指标的分析，发现高剂量组雄性大鼠的平均红细胞体积轻微增加，但在历史对照范围内且在恢复期未观察到；血清胆汁酸等指标的显著变化缺乏剂量-效应关系或在历史范围内。结论为受试物的给药对临床病理参数未产生不良影响。

3.4.4. Sperm analysis and estrous cycles
通过对雌性动物的动情周期和雄性动物精子生成的分析，发现给药未影响雌性的动情周期规律和长度，也未影响雄性的精子生成周期。高剂量组雄性总精子计数显著下降，但个体值在历史对照范围内，且对照组精子计数相对偏高。结论为受试物对生殖系统参数未产生不良影响。

3.4.5. Organ weights and macroscopic and microscopic examinations
通过对器官重量、肉眼病理和显微镜检查的分析，结果显示器官重量未受影响，也未发现与受试物相关的肉眼或显微镜异常，观察到的偶然发现是该年龄段Wistar Han大鼠的典型特征。结论为受试物在器官层面未产生毒性损伤。

在讨论部分，研究人员指出，按照国际科学机构如欧洲食品安全局的要求，通过标准的一级测试证明了IgG结合蛋白CBB缺乏遗传毒性。在细菌回复突变试验中使用了“处理和洗涤”程序以防止测试蛋白质时因氨基酸释放导致假阳性结果。微核试验也未发现致裂变或非整倍体诱变效应。基于13周口服毒性研究，特定IgG结合蛋白CBB的未观察到有害作用剂量被确定为614 mg/kg bw/day。虽然有一些统计学差异，如平均红细胞体积增加、血尿素氮增加和总精子计数减少等，但缺乏剂量-效应关系、具有性别特异性或幅度较小且在历史对照范围内，同时缺乏相关的宏观或组织病理学发现，支持这些效应与正常生物变异有关。根据未观察到有害作用剂量，可以确定每日允许摄入量。对一般人群的安全上限可高达6.14 mg/kg bw/day，若应用EFSA NDA Panel推荐的额外不确定系数2，则支持每日口服摄入量高达3.07 mg/kg bw/day。与估计的潜在高水平每日摄入量相比，提供了足够的安全边际，支持其在食品和饮料产品中的拟议用途。基于计算机模拟致敏性评估，IgG结合蛋白CBB不太可能引起免疫球蛋白E交叉反应的风险。此外，由于IgG结合蛋白CBB是通过精准发酵具有QPS状态的K. phaffii生产的，且其他宿主细胞蛋白含量极低，因此总体证据满足监管安全要求。

在结论部分，研究人员总结道：通过细菌回复突变试验和体外哺乳动物细胞微核试验证明了其缺乏遗传毒性潜力，以及在大鼠13周口服灌胃毒性研究中未观察到不良反应，从而证明了IgG结合蛋白CBB用于普通人群食品和饮料的安全性。此外，基于计算机模拟致敏性评估，预计IgG结合蛋白CBB不会引起致敏性交叉反应。