生物活性化合物在油包水型高内相乳液中的共递送：稳定性、体外消化及细胞毒性

《Food Chemistry》：Co-delivery of bioactive compounds in W/O high internal phase emulsions: Stability, in vitro digestion, and cytotoxicity

　　

•水包油高内相乳液共递送了儿茶素和β-胡萝卜素。
•脂肪分解得到增强，特别是在生物活性化合物浓度较高时。
•乳液能抵抗胃部环境，仅在肠道阶段发生相反转。
•共递送增强了每种生物活性化合物的生物可及性。
•体外消化的配方在分化的 Caco-2/HT29-MTX 共培养物中显示出无细胞毒性。

引言
消费者对结合必需营养素且热量较低的健康食品的需求不断增长，正在推动食品设计的创新。然而，保留理想的感官特性，包括质地、外观和粘度，仍然是一个主要挑战（Okuro 等，2019；Pan 等，2025）。为此，开发能够保留这些属性的先进胶体系统已成为食品研究的焦点。其中，高内相乳液（HIPEs），特别是水相内部成分超过 74%（w/w）的水包油（W/O）系统，因其固有的稳定性、奶油状质地以及封装化合物控释潜力而受到越来越多关注（Lee 等，2019）。此外，它们可作为涂抹酱、调味品、甜点或酱汁等食品中的脂肪替代品，从而能够开发热量密度较低的健康配方。

将生物活性化合物掺入此类递送系统，是增强其物理化学稳定性、功能性和生物可及性的关键策略（Zhang, Li 等，2023）。最近的综述进一步强调，HIPEs 是开发下一代功能性食品最有前景的胶体平台之一，因为它们具有高封装效率、可调节的微结构以及同时递送亲水和亲脂生物活性化合物的能力（Zhai 等，2026；Zhang 等，2025）。

尽管前景广阔，但实现稳定的 W/O HIPEs 仍然具有挑战性，特别是在乳化剂和稳定剂的选择方面（Fonseca 等，2023）。目前可用的化合物数量有限。例如，聚甘油蓖麻醇酯（PGPR）能有效降低 W/O 乳液的界面张力（McClements, 2005；Prichapan 等，2017），而蜡则有助于连续油相的结构化，从而增加粘度并限制液滴 mobility。最近的研究还表明，食用蜡和其他油脂凝胶剂可以有效地定制 W/O HIPEs 的微结构和胃肠道行为，强化其作为功能性递送系统的潜力（Miao 等，2025）。然而，生物活性化合物的掺入可能会以有益和有害的方式干扰乳液稳定性。因此，了解这些相互作用至关重要，因为稳定剂和封装生物活性化合物之间的效应可能显著影响消化过程中的乳液行为，最终影响化合物的释放和生物可及性（Okuro 等，2019）。

绿茶提取物（GTE）中的儿茶素，主要存在于绿茶（Camellia sinensis L.）中，是公认具有抗炎和抗氧化特性的酚类黄酮。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量最丰富，并与预防神经退行性疾病、炎症疾病、癌症和冠心病有关（Bernatoniene & Kopustinskiene, 2018；Rashidinejad 等，2021）。β-胡萝卜素是水果和蔬菜中的主要类胡萝卜素，广泛用作色素，具有高的抗氧化活性和维生素 A 原功能。将其掺入油相可减少加工、储存和消化过程中脂质和其他生物活性化合物的氧化（Gomes 等，2023）。因此，了解这些化合物的消化过程对于评估它们通过 W/O HIPEs 递送时的吸收和生物有效性至关重要。共释放策略表明，多酚可以提高类胡萝卜素的化学稳定性和生物可及性，减少消化过程中的降解（Cornacchia & Roos, 2011；Liu 等，2015）。然而，大多数研究局限于常规乳液，对高结构系统（如高内相乳液（HIPEs））的关注甚少，其生产和稳定仍代表一项挑战（Murray, 2019）。

体外消化模型提供了一种简单且可重复的策略来评估生物可及性。其中，标准化的 INFOGEST 方案已被广泛应用（Brodkorb 等，2019）。此外，为了评估肠道细胞反应，消化物可在模拟消化成分与人肠上皮相互作用的细胞基体外模型中进行测试（Parente 等，2022）。为了探索 W/O HIPEs 作为递送系统的潜力，在本研究中，GTE 中的儿茶素被添加到内部水相中，而β-胡萝卜素被掺入连续油相中（Torcello-Gómez 等，2011）。在两个相中纳入这两种具有抗氧化活性的化合物，作为一种有前景的策略出现，旨在增强加工和储存期间的物理化学稳定性，同时能够调节其在胃肠道条件下的释放和吸收动力学，潜在地最大化其功效。据我们所知，关于在 W/O HIPEs 中共递送β-胡萝卜素和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的研究很少，或者关于评估其结构如何影响消化过程中的功能性的研究也很少。最近进展表明，尽管 HIPEs 作为多功能递送系统已被越来越多的探索，但同时评估共封装、胃肠道条件和生物性能的研究仍然很少（Miao 等，2025；Sun 等，2026；Zhang 等，2025）。

尽管 W/O HIPEs 已成为生物活性化合物封装和递送的有前景平台，但以往的研究主要集中在配方开发、物理化学稳定性、流变行为和结构表征上，相对而言对其胃肠道命运和功能性能的关注较少（Acosta 等，2015；Lopez-Polo 等，2020；Miao 等，2025；Sun 等，2026；Taarji 等，2022；Zhang 等，2022）。最近的综述进一步强调了建立 HIPE 微结构、脂质消化、生物可及性以及封装化合物递送效率之间明确关系的必要性，特别是在 W/O 系统中（Miao 等，2025；Zhang 等，2025）。与此同时，最近的研究表明，由蛋白质或 Pickering 颗粒稳定的 HIPEs 可以有效增强亲脂性生物活性化合物的稳定性和生物可及性，包括β-胡萝卜素和虾青素（Wang 等，2026；Zhang 等，2026）。然而，涉及蜡结构 W/O HIPEs 的研究仍然有限，特别是那些涉及亲水和亲脂生物活性化合物同时递送以及对其胃肠道行为和生物性能进行全面评估的研究。

为了解解决这些知识空白，本研究调查了向日葵蜡结构的 W/O HIPEs，同时在油相中负载β-胡萝卜素，在水相中负载来自 GTE 的绿茶儿茶素。基于基于 HIPE 的递送系统的最近进展，这项工作将物理化学表征与体外消化、脂肪分解、生物可及性、相行为和细胞相容性分析相结合，为蜡诱导结构化如何影响亲水（来自 GTE 的儿茶素）和亲脂（β-胡萝卜素）生物活性化合物的胃肠道命运和递送效率提供了新的见解。

向日葵蜡（SW, 6607 L；熔点 74–80 °C）由德国 Trittau 的 Kahl GmbH & Co, KG 慷慨提供，用作结构剂。聚甘油蓖麻醇酯（PGPR, GRINSDTED?）由巴西 Cotia 的 Danisco Brazil Ltda 捐赠，用作乳化剂。葵花籽油（SFO, Fula?，葡萄牙）从当地市场（葡萄牙 Braga）购买，根据供应商报告，由亚油酸（44.2%）和油酸（48.7%）组成，用作油相。β-胡萝卜素（纯度≥ 93%）购自美国密苏里州圣路易斯的 Sigma-Aldrich。来自 GTE 的儿茶素，含有>94% 的表没食子儿茶素（EGCG），其他儿茶素衍生物含量较少（<5%），购自中国 Teavigo?。猪胰腺胰酶（胰蛋白酶活性 6.96 U/mg）购自美国密苏里州圣路易斯的 Merck。胃脂肪酶（RGE15）购自法国 Lipolytech?，显示出 15 ± 2 U/mg 脂肪酶和 550 ± 50 U/mg 胃蛋白酶的活性。猪胆提取物购自美国加利福尼亚州圣克鲁斯的 ChemCruz?（Santa Cruz Biotechnology INC），提取物中含有 1.94 mmol/g 的胆汁盐。

Caco-2 细胞（HTB-37 克隆）从美国典型培养物保藏中心（ATCC?）获得，HT29-MTX-E12（ECACC 12040401）从欧洲认证细胞培养物保藏中心获得。伊格尔最小必需培养基（MEM）购自德国 Aidenbach 的 PAN-Biotech GmbH。青霉素/链霉素 100×、胎牛血清（FBS）、汉克平衡盐溶液（HBSS）、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶-EDTA（0.25% 胰蛋白酶；0.1% EDTA）、多聚甲醛（PFA）、牛血清白蛋白（BSA）、fluoroshield?、丙酮酸钠、雪兰夫钠盐、杜尔贝科伊格尔培养基 - 高糖（DMEM）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自美国圣路易斯的 Merck。

W/O HIPEs 基于 Fonseca 等人（2023）和 Okuro 等人（2019）的方法制备，并有细微修改。简而言之，使用固定的水相 - 油相比例 80:20（w/w）。油相由葵花籽油和稳定剂混合物（0.5% w/w PGPR + 0.5% w/w SW）组成，含或不含β-胡萝卜素（0.01% 或 0.02% w/w）。水相为去离子水，含或不含来自 GTE 的儿茶素（0.135% 或 0.270% w/w）。浓度基于初步测定确定，在测定中生物活性化合物不干扰乳液形成过程，并考虑了在各相中的溶解度极限（图 S1）。

稳定剂首先在 80 ± 2 °C 下磁力搅拌（250 rpm）30 分钟溶于葵花籽油中。然后将油分散体转移到夹套烧杯（80 ± 2 °C）中，并使用 Watson 120 U 蠕动泵（Watson-Marlow Fluid Technology Pumps Group - 英国）以 2.0 mL/min 的流速逐滴加入水相，同时使用转子 - 定子系统（Ultra Turrax T18, IKA, Staufen, 德国）以 14,000 rpm 进行均质。水相完全加入后（约 30 分钟），转速降低至 11,000 rpm，并均质 2 分钟。新制备的 W/O HIPEs 在冰浴中冷却 30 分钟，然后在 5 ± 1 °C 或 23 ± 1 °C 下储存至少 24 小时以进行进一步分析。配方的详细组成总结在表 1 中。

在室温（约 23 °C）下使用 Ni-E 直立宽场/荧光显微镜（尼康，日本东京）观察 W/O HIPEs 的微结构，配备两个相机端口：用于明场成像的彩色相机（DS-Fi2, 尼康，日本东京）和用于成像的单色相机（Orca R2, Hamamatsu, 日本）。样品在制备 24 小时后和在 25 °C 下储存 30 天后，使用 20 × LU Plan Fluor EPI P 物镜成像。使用 NIS Elements 成像软件（版本 4.30.2, 尼康，日本东京）进行图像采集和处理。对于荧光显微镜，乳液在制备后立即用 0.25%（w/w） Nile Red 荧光染料染色，并使用 530 nm 激发激光收集图像。

W/O HIPEs 的液滴大小分布通过光学显微镜获得，如下所示。每张显微照片测量大约一百个液滴，对每种配方和储存时间分析多张显微照片。结果，每个样本总共评估了大约 1200 个液滴，确保具有统计代表性的液滴大小分布，使用 ImageJ 软件进行评估。基于测量的液滴直径，根据方程（1），（2）计算表面加权（D?,?）和体积加权（D?,?）平均直径，以及根据方程（3）计算分布的多分散指数（span）。

D32=∑nidi3∑nidi2
D43=∑nidi4∑nidi3
Span=d90?d10d50

其中 ni 是直径为 di 的液滴数量，d10、d50 和 d90 分别是累积体积的 10%、50% 和 90% 处的直径。

流变学测量使用配备珀尔帖温控系统的 Anton Paar MCR302e 流变仪（Anton Paar, Graz, 奥地利）进行。使用板 - 板几何形状（? = 25 mm），间隙为 0.5 mm。在 23 ± 0.1 °C 下，使用剪切速率范围为 0 到 300 s?1 的流变曲线评估 W/O HIPEs 在剪切后恢复粘度的能力。流变曲线在三个连续流步骤中获得：上 - 下 - 上循环。迟滞（定性触变性）是通过计算第一条和第三条曲线之间的面积获得的（Fonseca 等，2023；Sato & Da Cunha, 2007；Tanglertpaibul & Rao, 1987）。这些测量在时间零（HIPE 生产后 24 小时）和储存三十天后进行。

进行了振荡测量（应变、频率和温度扫描）。在恒定频率 1 Hz 下进行应变扫描，以确定 W/O HIPEs 的线性粘弹性区域（LVR）。然后，在 LVR 内的应变值（0.1% 应变）下评估频率扫描（0.01–100 Hz）。通过记录储能（G′）和损耗（G″）模量作为频率的函数来评估 W/O HIPEs 的频率依赖行为。此外，在冷却和加热步骤中调查了弹性（G′）和粘性（G″）模量的行为，以分别评估溶胶 - 凝胶和凝胶 - 溶胶转变。

温度扫描以 5 °C/min 的速度获得，固定频率（1 Hz）和在 LVR 内定义的应变值（0.1% 应变）。最初，设备冷却至 5 °C 以放置样品，然后加热至 90 °C。在这次第一次升温后，样品从 90 °C 冷却至 5 °C。

凝胶化温度 (Tsol-gel) 评估为模量随温度增加而开始上升（起始点）时的温度，而 Tgel-sol 则根据模量开始下降的起始点获得。W/O HIPEs 的稳定性通过目视检查进行评估。新制备的乳液置于平底圆柱形玻璃管中（高 120 mm，直径 16 mm），存放在室温（23 ± 2 °C）或冷藏（5 ± 2 °C）条件下。在 60 天内定期记录图像以监测宏观变化。W/O HIPEs 的体外消化遵循标准化的静态 INFOGEST 协议（Brodkorb et al., 2019; Minekus et al., 2014）进行，以模拟人类胃肠道条件。为了考虑消化过程中的稀释，模拟流体（唾液、胃液和肠液）制备为 1.25 倍浓度。根据协议规定测定酶活性（胰蛋白酶在胰酶中）和胆盐浓度。模拟流体储保存在 -20 °C，而酶和 CaCl?溶液在每次实验前新鲜制备。消化测定在 50 mL Falcon 管中进行，使用热混合器 Eppendorf ThermoMixer? C（Eppendorf, Hamburg, Germany），转速为 250 rpm，温度为 37 °C。含有 50 mg 脂肪（相当于 250 mg HIPEs）的样品在 1 mL milli-Q 水中制备，并依次接受口腔、胃和肠道阶段的处理。在口腔阶段，样品与模拟唾液流体、CaCl?和水混合，孵育 2 分钟。对于胃阶段，将口腔食团与模拟胃液、胃酶（胃脂肪酶和胃蛋白酶）和 CaCl?结合，并将 pH 值调节至 3.0。样品孵育 2 小时。在肠道阶段，向胃食糜中加入模拟肠液、胰酶、胆盐和 CaCl?，并将 pH 值调节至 7.0。样品孵育 2 小时。为了终止消化，加入 40 μL 奥利司他（甲醇中 5 mmol/L）。样品离心（3000g, 4 °C, 20 分钟），收集上清液（胶束相，即生物可及部分）进行进一步分析，包括生物可及性和体外细胞实验。作为消化的空白或对照，当在细胞中测试消化物时，在相同条件下消化 1 mL 超纯水。进行消化是为了在消化阶段期间通过显微镜评估消化物 - 消化前、胃阶段和肠道阶段后（第 2.2.2 节），以及用于脂肪分解分析（第 2.3.1 节）和生物可及性评估（第 2.4 节）。游离脂肪酸（FFAs）的释放通过 pH 电位滴定法定量，这是一种常用于评估脂肪分解的方法。W/O HIPEs 的脂质消化在体外消化 2 小时肠道阶段期间根据 COST INFOGEST 协议（Brodkorb et al., 2019）进行评估，并进行了轻微修改（Martins et al., 2025; Sabet et al., 2022）。在肠道阶段，使用自动 pH 电位滴定系统（控制添加 0.050 mol/L NaOH）持续将 pH 值维持在 7.0 ± 0.1。在 2 小时肠道消化结束时，进行反滴定步骤。在此步骤中，将系统的 pH 值升高至 9.0 并额外维持 2 小时。记录达到并稳定在 pH 9.0 所需的额外体积。此步骤用于确保所有 FFAs 去质子化并发生完全中和。在相同条件下进行了两个对照实验：（i）仅含有去离子水和消化流体的消化空白；（ii）含有所有成分（包括生物活性化合物和稳定剂）但不含油相的制剂空白。所得滴定值用于校正背景滴定，避免高估脂质水解。NaOH 消耗量确定为连续肠道阶段和反滴定步骤中消耗的 NaOH 体积之和。然后从每个实验条件中减去平均空白值。应用公式（4）（AOCS, 2009; Li & Mcclements, 2010）计算 FFA 释放量，以量化脂肪分解的程度。FFA%= [(V_NaOH_sample - control) × m_NaOH × M_lipid] / [W_lipid × 2] × 100，其中 V_NaOH 是中和生成的 FFA 所添加的 NaOH 溶液体积（mL）；m_NaOH 是 NaOH 溶液的摩尔浓度（mol/L）；M_lipid 是脂质相的等效分子量（g/mol），根据葵花籽油的脂肪酸组成计算（28.14 g/mol）（AOCS, 2009）；W_lipid 是 W/O HIPEs 中的脂质质量（g）。通过量化体外消化后获得的胶束相（上清液）中的浓度来评估来自 GTE 的 β-胡萝卜素和儿茶素的生物可及性。定量使用配备二极管阵列检测器（DAD）的高效液相色谱（HPLC, Agilent 1260 Infinity Quaternary LC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）进行，遵循溶剂 - 溶剂萃取步骤以分离每种生物活性化合物。所有分析均使用 Kinetex 2.6 μm C18 100 ? 色谱柱（150 × 4.6 mm; Phenomenex, Torrance, CA, USA），进样体积为 20 μL。HPLC 分析前进行溶剂 - 溶剂萃取。体外消化后，样品在 4000g, 4 °C 下离心 30 分钟，以将胶束相与未消化的物质分离。小心收集上清液（胶束相），必要时在分析前过滤。所有处理步骤均在低光条件和受控温度下进行，以最小化来自 GTE 的 β-胡萝卜素和儿茶素的降解（它们是光敏和氧化敏感的）。样品收集时间和 HPLC 分析尽可能缩短。对于 β-胡萝卜素的提取和定量，取 0.2 mL 胶束相的分液转移至烧瓶中，与 0.6 mL Milli-Q 水、1.8 mL 丙酮和 0.3 mL 乙醇混合。之后，加入 1.2 mL 己烷，混合物倒置 10 次，并静置 5 分钟以进行相分离。收集上层己烷层。随后，在相同条件下进行第二次提取，并将两个提取液合并。在氮气流下蒸发溶剂，并将体积调整至 2 mL（Wright et al., 2008）。提取液通过 0.45 μm PTFE 膜过滤，并转移至棕色玻璃小瓶（带玻璃内衬）中。HPLC 分析在等度条件下进行（90% 甲醇，10% 乙腈），流速为 1.8 mL/min，总运行时间为 10 分钟。在 474 和 450 nm 处检测 β-胡萝卜素，保留时间约为 7 分钟（Martins et al., 2025）。β-胡萝卜素的定量基于在己烷中制备的标准曲线，范围为 3–200 μg/mL（y = 3.2556x - 19.19, R2 = 0.9984）。提取程序基于先前验证的方案，报告了基于脂质的基质中类胡萝卜素定量的适当回收率和重现性（Wright et al., 2008; Salvia-Trujillo et al., 2013; McClements et al., 2015; McClements, 2018; McClements & Jafari, 2018）。对于来自 GTE 的儿茶素的提取，将 1 mL 胶束相与 4 mL 甲醇混合，涡旋 1 分钟，并以脉冲模式超声 15 分钟。样品在 4000g, 4 °C 下离心 30 分钟，收集上清液。在氮气流下蒸发甲醇至最终体积 2 mL。提取液通过 0.22 μm PVDF 膜过滤，并转移至棕色玻璃小瓶中（Silva et al., 2024）。HPLC 分析流速为 1.0 mL/min，使用溶剂 A（含 2% 乙酸的水）和溶剂 B（乙腈）的线性梯度，从 90:10 到 0:100 (A:B)，总运行时间为 25 分钟，改编自 Li et al. (2012)。在 280 nm 处检测来自 GTE 的儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的保留时间约为 5.8 分钟，表儿茶素（EC）约为 8.8 分钟。定量基于用甲醇中的标准 EGCG 溶液制备的校准曲线，浓度范围为 10 到 600 μg/mL。校准方程分别为 EGCG 的 y = 20.442x ? 324.01 (R2 = 0.9998) 和 EC 的 y = 1.6121x ? 8.5472 (R2 = 0.9991)。HPLC 定量使用 EGCG 和 EC 进行。因此，本文献中使用的术语“来自 GTE 的儿茶素”指的是量化的来自 GTE 的儿茶素总和（EGCG + EC），而不是提取物的总儿茶素组成。校准曲线和代表性色谱图在补充材料中呈现。随后将这两种化合物的浓度相加，以代表来自 GTE 的总儿茶素。分析方法基于先前验证的 HPLC 方案，在类似条件下引用的文献中报告了线性、敏感性和精密度（Li et al., 2012; Li et al., 2020; Silva et al., 2024; Wei et al., 2020; Yang et al., 2020）。根据公式（5）计算生物可及性值。生物可及性%= (C_micellar phase / C_HIPE initial) × 100，其中 C_HIPE initial 和 C_micellar phase 分别是初始 HIPE 和胶束相中的生物活性化合物含量。这里生物可及性定义为体外消化后存在于胶束相中的化合物分数，代表可能可用于肠道吸收的部分。Caco-2 和 HT29-MTX 细胞保存在加湿培养箱中（相对湿度 95%，37 °C，5% CO?）。培养基每 2–3 天更换一次，当细胞汇合度达到 80–90% 时，使用胰蛋白酶 5 分钟进行传代。对于半汇合 Caco-2 细胞的测试，将 1.0 × 105 cells/cm2（200 μL/well 的 160,000 cells/mL 悬浮液）接种在 96 孔板（TPP 92096）中，过夜孵育，然后进行治疗。使用半汇合培养物来测试游离（未消化）生物活性物质在不同浓度下对细胞活力的影响。对于共培养实验，将 Caco-2 和 HT29-MTX 细胞以 9:1 的比例以 1.0 × 105 cells/cm2 的密度接种在 96 孔板中，孵育 21 天以允许单层分化。使用分化后的共培养物来评估消化样品对细胞活力的影响。a.游离（未消化）生物活性化合物 作为初步筛选，使用染色素还原法评估游离生物活性化合物（β-胡萝卜素或来自 GTE 的儿茶素）对半汇合 Caco-2 细胞代谢活性的影响。使用培养基作为阳性对照，培养基中的 40% DMSO 作为阴性对照。使用 β-胡萝卜素储备液（乙醇中 2 mg/mL）制备中间溶液，并在 MEM 中稀释以获得 2–200 μg/mL 的最终 β-胡萝卜素浓度，乙醇固定为 1% (v/v)。类似地，使用 GTE 储备液（超纯水中 20 mg/mL）制备中间溶液，并在 MEM 中稀释以获得 2–200 μg/mL 的最终来自 GTE 的儿茶素浓度，水固定为 10% (v/v)。与细胞孵育 24 小时后，去除处理物并替换为染色素溶液（培养基中 10 μg/mL）。在标准条件下孵育 4 小时后，使用微孔板读数器（Synergy Biotek H1, USA）测量 resorufin（激发 560 nm，发射 590 nm）——染色素的还原形式——的荧光。细胞活力表示为相对于阳性对照的百分比，设定为 100% 细胞活力。b.W/O HIPE 消化物 在分化后的 Caco-2:HT29-MTX 共培养物（9:1 比例）中评估消化的 W/O HIPE 对细胞代谢活性的影响。为抑制蛋白酶活性，向消化物中加入 Pefabloc?，最终浓度为 5 mmol/L。胶束相（上清液）在 MEM 中以 1:10 稀释用于细胞测定。分化 21 天后，细胞暴露于消化样品或对照物 4 小时。孵育后，去除消化物或对照物，并替换为染色素溶液（完全 MEM 中 10 μg/mL），再孵育 3 小时。对照包括 40% (v/v) DMSO（阴性对照），含 10% (v/v) 超纯水的 MEM（载体对照）或 1% (v/v) DMSO（载体对照）或消化水（消化背景的对照）。荧光测量和数据分析如第 2.5.3 节所述。实验数据表示为均值 ± 标准差，并使用软件 SISVAR 5.7（Ferreira, 2011）进行单因素方差分析（ANOVA）。使用 Tukey 检验评估处理间均值之间的显著差异（p < 0.05）。所有 HIPE 制剂均在两个独立的批次（重复）中制备。对于每个批次，所有分析均进行三次重复（技术重复），包括显微镜检查、流变学、体外消化测定、HPLC 定量和基于细胞的测定。每个批次的技术重复取平均值，报告的值对应于两个独立批次的均值 ± 标准差。章节片段 液滴尺寸分布和微观结构 由于生产和稳定 W/O HIPEs 的固有挑战，进行了初步试验，使用不同水平的结构剂和生物活性化合物（来自 GTE 的儿茶素和 β-胡萝卜素），以防止相分离并实现宏观稳定的乳液，其定义是无可见相释放。至少需要 0.5% (w/w) 聚甘油蓖麻醇酯（PGPR）和 0.5% (w/w) SW 以确保结构稳定性。此外，不同浓度的... 结论 使用较低浓度的稳定剂，开发同时掺入来自 GTE 的儿茶素和 β-胡萝卜素的 W/O HIPEs 被证明是有效的，并突显了其作为生物活性化合物递送平台的潜力。

所有配方均表现出类似凝胶的行为，并在长达 60 天内保持宏观稳定性，尽管在储存期间观察到液滴聚结和轻微变暗，特别是在 23 °C 下负载 GTE 的 W/O HIPEs 中的儿茶素。体外消化显示

CRediT 作者贡献声明
Larissa Ribas Fonseca：写作 – 初稿，方法论，调查，形式分析，概念化。Marisol Goveia Dias：方法论，形式分析。Ana Isabel Bourbon：写作 – 审查和编辑，方法论，形式分析。Fernanda L. Ludtke：方法论，形式分析。António Vicente：资金支持。Miguel A. Cerqueira：写作 – 审查和编辑，概念化。Lorenzo Pastrana：资金支持。Tatiana Porto dos Santos：写作 – 审查和编辑，

未引用参考文献
Chen 和 Zhang, 2020; McClements 和 Li, 2010; Park, Mun 和 Kim, 2018

利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能被认为影响了本论文报告的工作。

致谢
作者感谢 #2019/27354-3 资助，圣保罗研究基金会（FAPESP）。Fonseca 感谢圣保罗研究基金会 - FAPESP (#2020/15929-9) 和 (# 2023/11898-0)。财政代码 001。Rosiane Lopes Cunha 感谢 CNPq (307094/2021-9) 提供的生产力资助。Ana Isabel Bourbon 承认通过个人科学就业项目合同 (2020.03447.CEECIND) 获得 FCT 的资金支持。作者承认 VIIAFOOD 议程（项目编号 37，申请编号 C644929456-00000040），

Larissa Ribas Fonseca|Marisol Goveia Dias|Ana Isabel Bourbon|Fernanda L. Ludtke|António Vicente|Miguel A. Cerqueira|Lorenzo Pastrana|Tatiana Porto dos Santos|Rosiane Lopes Cunha|Catarina Gon?alves