利用芽孢杆菌属固态发酵提升豆粕附加值：蛋白质水解、营养强化与生物活性改善

《Food Chemistry: X》：Value-adding soybean meal via solid-state fermentation with Bacillus species: Protein hydrolysis, nutritional enhancement, and bioactivity improvement

　　

为了提升豆粕（soybean meal, SBM）的增值利用，本研究评估了枯草芽孢杆菌Z1（Bacillus subtilis Z1）、贝莱斯芽孢杆菌Z2（Bacillus velezensis Z2）和解淀粉芽孢杆菌Z3（Bacillus amyloliquefaciens Z3）在固态发酵（solid-state fermentation, SSF）过程中对蛋白质水解、结构变化和生物活性的影响。发酵显著促进了蛋白质的溶解和水解，可溶性蛋白和肽含量分别增加了5.88–6.90倍和5.22–6.33倍。值得注意的是，游离氨基酸含量大幅增加，尤其是必需氨基酸（essential amino acids, EAAs）增加了20.26–26.02倍，其中采用解淀粉芽孢杆菌Z3发酵的豆粕中EAA比例达到47.52%。SDS-PAGE和HPSEC分析进一步证明了SSF后蛋白质的水解以及肽分子量分布的改变。FTIR分析显示，SSF破坏了天然蛋白质构象，并诱导了显著的二级结构重排。此外，SSF后豆粕的抗氧化活性和金属螯合活性显著增强。这些发现为蛋白质生物转化提供了有价值的见解，并支持开发有效的豆粕营养升级和增值策略。

全球人口持续增长和可持续食品系统需求上升，使优质蛋白质需求显著增加。豆粕（soybean meal, SBM）是大豆榨油的主要副产物，年产量超过2.5亿吨，因其来源广、蛋白质含量高、氨基酸谱均衡而被视为重要植物蛋白来源。然而，豆粕蛋白质主要以结构稳定的贮藏蛋白形式存在，复杂构象限制了消化酶的可及性；同时，豆粕含有胰蛋白酶抑制剂、抗原蛋白和非淀粉多糖等抗营养因子，显著降低其消化率和生物利用度，制约其进一步增值化。因此，分解豆粕致密的蛋白质基质并消除抗营养因子，不仅是提升营养消化率的关键，也是释放其功能性生物活性化合物潜力的前提。固态发酵（solid-state fermentation, SSF）作为一种生物技术手段，具有低水耗、低能耗、操作条件简单、成本低等优势，并能通过微生物分泌的多样化酶系将大分子化合物转化为营养代谢物、降解抗营养因子。在此背景下，研究人员利用实验室保存的枯草芽孢杆菌Z1（Bacillus subtilis Z1）、贝莱斯芽孢杆菌Z2（Bacillus velezensis Z2）和解淀粉芽孢杆菌Z3（Bacillus amyloliquefaciens Z3）对豆粕进行SSF，系统评价了蛋白质水解、结构变化、营养组成、生物活性及功能特性的影响，以期为豆粕的高值化利用提供理论依据。研究结果证明，三种芽孢杆菌固态发酵能有效促进豆粕蛋白水解，显著提升可溶性蛋白、肽和游离氨基酸含量，优化必需氨基酸谱，降低抗营养因子，增强抗氧化与金属螯合活性，并改善功能特性。该研究为植物蛋白的生物转化及豆粕营养升级和增值策略的开发提供了重要见解。论文发表于《Food Chemistry: X》。

作者使用的主要技术方法包括：以山东瑞祥饲料有限公司提供的豆粕为底物，采用三种芽孢杆菌进行固态发酵制备发酵豆粕（FSBM）；使用BCA法测定可溶性蛋白和肽含量，采用甲醛滴定法测定α-氨基氮，利用高效液相色谱（HPLC）分析游离氨基酸组成；通过SDS-PAGE分析蛋白质降解模式，结合高效尺寸排阻色谱（HPSEC）测定肽分子量分布；利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征蛋白质二级结构；通过比色法测定总酚和总黄酮含量，并按国家标准测定胰蛋白酶抑制剂活性；采用DPPH自由基清除法和铁还原抗氧化力（FRAP）评估抗氧化活性，以钙、铁螯合实验评价金属螯合能力，同时测定持水性和吸油性。

### 3.1 SSF enhanced the protein hydrolysis of SBM（SSF促进豆粕蛋白质水解）

通过定量分析可溶性蛋白、肽、α-氨基氮和游离氨基酸，发现发酵后各指标均显著提高。可溶性蛋白含量在FSBMZ2中最高（347.63 mg/g，为未发酵豆粕的6.90倍）；肽含量在FSBMZ3中最高（181.35 mg/g，为未发酵豆粕的6.33倍）；α-氨基氮在FSBMZ3中达到1.96%，为未发酵豆粕的24.54倍。总游离氨基酸在FSBMZ2中最高（3496.26 mg/100 g，为未发酵豆粕的12.02倍），必需氨基酸（essential amino acids, EAAs）比例在FSBMZ3中达47.52%，其中赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸等显著富集。上述结果表明，SSF能有效将豆粕贮藏蛋白降解为小分子肽和游离氨基酸，并改善氨基酸组成。

### 3.2 SSF improved the nutritional and bioactive composition of SBM（SSF改善豆粕营养和生物活性成分）

通过常规成分分析、比色法和酶抑制测定，发现发酵后粗蛋白含量由43.44%增加至49.00%–52.68%，粗脂肪显著降低，粗纤维最大降幅达83.95%（FSBMZ2），并伴随还原糖积累。总酚含量提高至未发酵豆粕的5.66–6.03倍，总黄酮含量提高至1.59–1.86倍。胰蛋白酶抑制剂活性最大降低91.82%（FSBMZ3），有效降低了抗营养因子水平。颜色分析显示发酵后豆粕L\*值降低、总色差ΔE增加，表明底物颜色变深。这些变化说明SSF改善了豆粕的营养构成，并促进了酚类、黄酮类生物活性物质的释放。

### 3.3 SSF drove the structural changes of SBM protein（SSF驱动豆粕蛋白质结构改变）

SDS-PAGE结果显示，未发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白（α、α'、β亚基）、大豆球蛋白（酸性亚基和碱性亚基）以及30 kDa过敏原Gly m Bd 30条带在发酵后显著减弱或消失，低分子量区域出现弥散条带。HPSEC分析表明，<2 kDa肽段比例由未发酵豆粕的26.37%增加至42.19%–47.40%。FTIR分析显示，酰胺I带从1651.49 cm^-1移至1637.31–1641.04 cm^-1，β-折叠含量由47.74%降至37.38%–41.86%，α-螺旋、β-转角和无规卷曲比例发生不同程度变化，同时氢键网络被破坏。上述结果证明SSF破坏了豆粕蛋白的天然构象，使蛋白质结构趋于松散无序，从而降低抗原性、提高消化率。

### 3.4 SSF strengthened the bioactivity and functional properties of SBM（SSF增强豆粕生物活性和功能特性）

通过DPPH、FRAP、金属螯合能力、持水性和吸油性测定，发现发酵后水提物DPPH自由基清除率由20.88%提升至48.47%–64.04%，醇提物为53.03%–67.26%；水提物FRAP值提高3.38–3.76倍，醇提物提高3.33–3.95倍。Ca²⁺螯合活性在FSBMZ2中最高（82.23 mg/g，为未发酵豆粕的2.92倍），Fe²⁺螯合活性在三种发酵豆粕中均有增强。持水性由3.86 g/g增至5.48–6.56 g/g，吸油性由3.55 g/g增至4.51–6.28 g/g。低分子量肽段的生成以及结构展开暴露的活性基团是上述生物活性和功能特性增强的主要原因。

### 3.5 Principal component and correlation analysis（主成分与相关性分析）

主成分分析（principal component analysis, PCA）和相关性矩阵显示，肽含量和总游离氨基酸含量与可溶性蛋白及低分子量肽段呈极强正相关（r ≥ 0.95），并与抗氧化活性（r ≥ 0.95）和金属螯合活性呈强正相关。其中，<2 kDa肽段与DPPH自由基清除活性相关性达r = 0.98–0.99，0.5–2 kDa肽段与FRAP相关性r ≥ 0.95，1–2 kDa肽段与Ca²⁺螯合活性相关性r ≥ 0.99。β-折叠含量与可溶性蛋白、总游离氨基酸及Ca²⁺螯合活性呈极强负相关（r = ?0.95至?1.00）。总酚含量与抗氧化活性呈强正相关（r = 0.96–0.97）。这些结果表明，SSF引起的蛋白质结构破坏和分子量降低与功能活性增强密切相关。

讨论部分强调，不同芽孢杆菌菌株的蛋白酶系统和代谢途径差异导致了发酵效果的菌株依赖性：FSBMZ2更有利于可溶