《Food Control》：Spore-Forming Bacteria in Plant-Based Milk Alternatives: Isolation, Identification, and Molecular Detection of Virulence and Heat Resistance Genes
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摘要翻译：植物基乳替代品（PBMAs）在巴西日益普及和快速扩张，凸显了评估其微生物质量和潜在安全风险的重要性。本研究旨在评估巴西市场上销售的111份PBMA样品的商业无菌性，分离产芽孢细菌，利用MALDI-TOF MS对回收菌株进行鉴定，并检测蜡样芽孢杆菌（B
摘要翻译：植物基乳替代品（PBMAs）在巴西日益普及和快速扩张，凸显了评估其微生物质量和潜在安全风险的重要性。本研究旨在评估巴西市场上销售的111份PBMA样品的商业无菌性，分离产芽孢细菌，利用MALDI-TOF MS对回收菌株进行鉴定，并检测蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）分离株中的9个毒力基因和6个耐热基因。在82份样品中，商业无菌性测试表明存在嗜温（35°C）或嗜热（55°C）生长，这通过分析方案推荐的培养基中的阳性反应得以证实。共获得139株需氧分离株，其中99株为嗜温菌，40株为嗜热菌。嗜温分离株包括蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、Bacillus siralis、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）和乳酸类芽孢杆菌（Paenibacillus lactis），而嗜热分离株包括嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）、嗜热黄厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus flavithermus）和苍白气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus）。对15株蜡样芽孢杆菌分离株的毒力和耐热谱分析显示，毒力基因cytK、bceT、entFM、nheA、nheB、nheC和hblC分别在73.3%、66.6%、26.6%、100%、86.6%、86.6%和93.3%的分离株中存在，耐热基因cdnL在所有分离株中均被检出。总体而言，本研究有助于更深入地理解与PBMAs相关的微生物风险。确保有效灭活产芽孢微生物，尤其是产毒素的蜡样芽孢杆菌菌株，至关重要，因为这些产品的成分可能有利于此类细菌的存续和增殖。
论文解读文章
**研究背景与问题**
近年来，植物基乳替代品（PBMAs）在全球范围内消费量显著增长，其驱动因素包括消费者对健康、伦理和环境可持续饮食的追求。在巴西，PBMAs市场迅速扩张，但对其微生物质量和潜在安全风险的评估却相对滞后。PBMAs通常以大豆、燕麦、大米、杏仁和坚果等植物原料经水提取、研磨、过滤、均质、调配和热处理等工序制成，其中超高温灭菌（UHT）处理旨在实现商业无菌。然而，由于产芽孢细菌（尤其是芽孢杆菌属）的芽孢具有极高的热抗性，可能残存于热加工后的产品中，加之加工后污染或储运控制不当，PBMAs仍存在微生物安全隐患。此外，PBMAs的营养成分（碳水化合物、蛋白质、脂质）、高水分活度和近中性pH值，为微生物生长提供了有利条件。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）群（即B. cereus sensu lato）作为典型代表，不仅可形成耐热芽孢，还能产生多种肠毒素和溶血素，导致食源性疾病。同时，该菌易在工业表面形成生物膜，成为持续污染的源头。然而，目前针对巴西市售UHT PBMAs中产芽孢细菌的生态学数据、毒力基因和耐热基因谱系尚属空白，这阻碍了有效的风险评估和微生物标准的制定。因此，开展本研究以填补这一关键空白，为优化热工艺、制定卫生策略和监管规范提供科学依据。
**研究内容与主要技术方法**
研究人员从巴西坎皮纳斯市9家超市收集了10个品牌、共111份UHT处理且常温销售的植物基水溶性提取物样品（涵盖燕麦、腰果、椰子、巴西坚果、杏仁、大豆、豌豆和大米等8种基础植物原料），每份样品均来自不同生产批次。首先，采用商业无菌性测试（使用PE-2培养基和葡萄糖胰蛋白胨肉汤，分别在35°C和55°C孵育7天）评估样品微生物生长情况；随后，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对形态学上具有差异的菌落进行物种鉴定；最后，针对鉴定为蜡样芽孢杆菌的分离株，采用PCR法检测9个毒力基因（cytK, bceT, entFM, nheA, nheB, nheC, hblA, hblB, hblC）和6个耐热基因（cdnL, clpC, dacB, dnaK, spoVAD, yitF）。此外，还测定了样品的pH值，并对产品标签营养成分信息进行了主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）。
**研究结果**
* **商业无菌性测试结果**：111份样品中，82份（74%）在35°C或55°C下出现培养基变色、产气或蛋白胨消化等阳性反应，表明存在嗜温或嗜热微生物生长。这一高比例提示大量UHT PBMAs未达到商业无菌状态，存在微生物存活或二次污染风险。
* **产芽孢细菌分离与鉴定**：共获得139株需氧产芽孢分离株（99株嗜温，40株嗜热）。嗜温菌以蜡样芽孢杆菌（53%）和Bacillus siralis（38%）为主，还包含短小芽孢杆菌（4%）、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（2%）、凝结芽孢杆菌（2%）和乳酸类芽孢杆菌（1%）。嗜热菌则主要为嗜热脂肪土芽孢杆菌（75%）、嗜热黄厌氧芽孢杆菌（20%）和苍白气芽孢杆菌（5%）。杏仁基样品检出频率最高，其次为椰子、腰果、大豆和燕麦。
* **蜡样芽孢杆菌毒力与耐热基因谱**：在15株分离自不同样品的蜡样芽孢杆菌中，毒力基因检出率分别为：nheA（100%）、hblC（93.3%）、nheC（86.6%）、nheB（86.6%）、cytK（73.3%）、bceT（66.6%）、entFM（26.6%）。所有15株菌均携带耐热基因cdnL，但未检出clpC、dacB、dnaK、spoVAD和yitF。研究表明，多数菌株携带多种肠毒素基因，具有潜在的致病风险；cdnL基因的普遍存在提示其可能参与芽孢的耐热机制，但需进一步表型验证。
* **产品营养与理化特性分析**：PBMAs的pH值介于6.54至8.31，呈中性至微碱性。PCA分析显示前两个主成分解释了总方差的63.7%（PC1：42.6%，PC2：21.1%），碳水化合物、蛋白质和脂肪含量是主要变异来源。HCA将样品分为5个主要簇，分别对应高热量型、高碳水低脂型、高脂低糖型、营养均衡型和未加糖型，表明营养成分（尤其是碳水与脂质平衡）比植物来源更能决定产品分类。
**讨论与结论**
本研究发现巴西市售UHT PBMAs中产芽孢细菌污染普遍，蜡样芽孢杆菌是主要嗜温污染物，其高毒力基因携带率构成潜在食品安全风险。嗜热菌（如G. stearothermophilus）的广泛存在则与产品货架期变质密切相关。研究指出，植物原料、加工环境生物膜及UHT处理不彻底是可能的污染来源。鉴于目前缺乏针对植物基饮品中芽孢杆菌的微生物标准，本研究结果强调需加强原料控制、优化热工艺参数、改善设备卫生设计，并建立基于证据的监管标准。结论部分明确指出，111份样品中74%未通过商业无菌性测试，回收的139株产芽孢菌中包含多种芽孢杆菌属和地芽孢杆菌属物种，其中蜡样芽孢杆菌的毒力基因检出率极高（nheA 100%），耐热基因cdnL在所有分离株中均存在。研究认为，控制产芽孢细菌需综合考量工艺卫生、技术屏障、设备设计和持续监测，本研究为巴西PBMAs的法规制定提供了科学依据。
