《Food Control》：Detection and differentiation of
Salmonella Typhimurium and
Salmonella Enteritidis in poultry meat using a machine learning-enabled paper chromogenic array sensor approach
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摘要：快速、准确地检测与食源性疾病相关的沙门氏菌血清型对于维护食品安全至关重要。本研究开发并评估了一种机器学习辅助的纸基显色阵列传感器（ML-PCA）方法的性能，该方法能够在有背景微生物群（BK）存在的情况下，于室温及冷藏温度（4°C）贮藏期间，对鸡胸肉中的鼠
摘要：快速、准确地检测与食源性疾病相关的沙门氏菌血清型对于维护食品安全至关重要。本研究开发并评估了一种机器学习辅助的纸基显色阵列传感器（ML-PCA）方法的性能，该方法能够在有背景微生物群（BK）存在的情况下，于室温及冷藏温度（4°C）贮藏期间，对鸡胸肉中的鼠伤寒沙门氏菌（ST）和肠炎沙门氏菌（SE）进行非破坏性、连续且同步的检测与区分。在室温条件下，ML-PCA方法在最早6小时即可实现对单一血清型、双血清型及血清型混合物的ST和SE检测，准确率达80–88%。在4°C条件下，ST和SE最早可在1天时被检测到，检测准确率超过80%。这些结果表明，ML-PCA方法能够实现对禽肉上ST和SE的非破坏性、连续且同步的检测与区分。该方法为整个食品系统中沙门氏菌的连续监测提供了一种潜在工具。
**论文解读：基于机器学习辅助纸基显色阵列传感器的禽肉中沙门氏菌血清型检测与区分研究**
**一、研究背景与问题**
沙门氏菌是全球范围内最常见的食源性病原体之一，也是引起人畜共患感染的主要原因，对公共卫生和食品工业构成了严峻挑战。据美国疾病控制与预防中心（CDC）估计，沙门氏菌每年在美国导致约135万例感染、26500例住院和420例死亡。在众多食品类别中，鸡肉是沙门氏菌感染的首要贡献来源，约占病例的19.7%。尽管已鉴定出超过2500种沙门氏菌血清型，但导致大多数人类感染的血清型不足100种。根据美国农业部食品安全检验局（USDA-FSIS）的数据，肠炎沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和I 4,[5],12:i:-是与鸡肉产品相关的最常见的公共卫生关注血清型。
快速、准确地检测和区分与食源性疾病相关的沙门氏菌血清型对于改善食品安全、流行病学监测、来源归因、毒力表征以及暴发调查至关重要。目前，USDA-FSIS微生物学实验室指南中基于培养的方法仍然是检测和鉴定禽肉中沙门氏菌及其血清型的金标准。然而，该方法劳动强度大、耗时久，通常需要至少5-7天才能获得结果并确认血清型，这增加了食品供应链中交叉污染和病原体传播的风险。此外，该方法需要超过150种抗血清，成本高昂且使检测复杂化，可能因弱或非特异性凝集而产生假阳性结果，且无法区分具有相似抗原公式的血清型。为克服这些局限，已开发了多种分子方法，如序列分析和多重聚合酶链反应，但这些方法仍需要多个富集和制备步骤，依赖设备完善的实验室和特定仪器，且可能因交叉反应或死细胞DNA而产生假阳性或假阴性结果。其他分析方法，如基于代谢组学和光谱学的方法，也受限于对精密且昂贵设备的需求。此外，大多数现有方法缺乏在整个食品系统中对沙门氏菌血清型进行实时或连续检测和区分的能力。
**二、研究内容与结论**
针对上述问题，研究人员开展了一项概念验证研究，旨在开发并评估一种机器学习辅助的纸基显色阵列传感器（ML-PCA）方法，用于在室温（21±1°C）和冷藏温度（4°C）贮藏条件下，在背景微生物群（BK）存在的情况下，对鸡胸肉上的鼠伤寒沙门氏菌（ST）和肠炎沙门氏菌（SE）进行非破坏性、连续且同步的检测与区分。该研究基于此前研究人员开发的ML-PCA方法，但此前的工作主要聚焦于病原体和物种水平的检测与区分，本研究则将这一方法推进至血清型水平的鉴别，以解决在实际食品基质中进行血清型水平区分的实际挑战。
研究结果表明，ML-PCA方法能够实现对ST和SE的有效检测和区分。在室温条件下，该方法在最早6小时即可实现检测，准确率达80-88%；在4°C条件下，最早1天即可检测，准确率超过80%。这项研究的创新之处在于将ML-PCA方法从物种水平提升至血清型水平，为沙门氏菌血清型的非破坏性、连续监测提供了新的技术途径。该研究发表在《Food Control》期刊上，其意义在于为食品安全领域提供了一种潜在的低成本、便携式、非破坏性的沙门氏菌血清型连续监测工具，有望整合到智能包装系统中，提升食品供应链中病原体监测的效率和能力。
**三、主要技术方法**
研究人员采用了以下几种关键技术方法：
1. **纸基显色阵列传感器（PCA）制备**：采用SU-8光刻胶光刻技术制备纸基微阵列，并将9种化学染料（包括4,4′-偶氮二苯胺、氯酚红、溴酚蓝等）精确点样至3×3阵列中，形成PCA。
2. **鸡胸肉样品接种与PCA组装**：将ST和SE以约3 log CFU/g的初始浓度接种至鸡胸肉表面，设置五种污染场景：背景微生物群（BK）、单一血清型ST（MN_ST）、单一血清型SE（MN_SE）、无共生双血清型（DS）和共生血清型混合物（CK），并将PCA固定在培养皿盖内表面进行封闭培养。
3. **数据采集与数据库构建**：使用Epson Perfection V39彩色扫描仪在特定时间点获取PCA图像，通过ImageJ软件提取每个染料点的平均R/G/B颜色空间值，计算颜色变化值（ΔR/ΔG/ΔB），并同时采集“ground truth”数据（温度、时间点、细菌种类/血清型和菌群数量），构建包含8位编码标签的综合数据库。样品来源为当地杂货市场购买的去皮去骨鸡胸肉。
4. **机器学习分析**：应用三种监督学习算法——k近邻（KNN）、支持向量机（SVM）和极端梯度提升（XGBoost）——对PCA颜色模式进行识别和分类，并通过分层5折交叉验证、主成分分析（PCA）降维和数据增强等技术优化模型性能。
**四、研究结果**
**（1）室温条件下细菌生长**：黄模型（Huang model）能够很好地描述鸡胸肉中背景微生物群和沙门氏菌在单一血清型、双血清型中的生长情况，均方根误差（RMSE）范围为0.53至0.81 log CFU/g。背景微生物群的滞后期（1.61小时）显著短于沙门氏菌（4.33-6.11小时），而沙门氏菌的生长速率在不同场景中无显著差异（0.32-0.33 h?1）。双血清型和血清型混合物中的沙门氏菌表现出比单一血清型更长的滞后期，这可能与挥发性有机化合物（VOCs）介导的种间相互作用和营养竞争有关。
**（2）冷藏温度下细菌存活**：在4°C条件下，背景微生物群在整个7天贮藏期间持续增殖，第7天达到6.89±0.11 log CFU/g，这归因于鸡肉中嗜冷菌的存在。相比之下，沙门氏菌在7天贮藏期间仅存活而不生长，第7天时菌群数量维持在约3 log CFU/g，这与沙门氏菌在鸡肉中的最低生长温度约为6°C的报道一致。
**（3）PCA颜色模式分析**：颜色差异图显示，在室温和4°C条件下，五种细菌污染场景均产生了略微不同且随时间变化的PCA颜色模式。在室温条件下，染料#1-5和#7在4-6小时即显示颜色变化，随后在8-48小时逐渐增强。在4°C条件下，PCA显示出较慢且不同的比色响应，表明温度对微生物VOC组成和释放速率有显著影响。
**（4）室温下ST和SE的检测与区分**：KNN和SVM模型在所有时间点均表现出良好的判别能力，训练准确率接近100%，验证准确率维持在约78-88%。在8小时时间点，KNN模型取得了最高测试准确率（88%），对五种场景（MN_ST、MN_SE、DS、BK、CK）的精确率、召回率和F1分数大多≥0.80，其中BK实现了完美分类（精确率=1.000，召回率=1.000，F1=1.000）。ROC曲线分析显示，各场景的AUC值范围为0.876至1.000。相比之下，XGBoost模型的性能较低，测试准确率低于80%。
**（5）4°C下ST和SE的检测与区分**：KNN和SVM模型在1至7天的所有时间点均达到较高的训练准确率（99.1%-100%），验证和测试准确率维持在77%-85%。最早在1天时，KNN和SVM模型的验证和测试准确率即可超过80%。在1天时间点，SVM模型对MN_ST和MN_SE表现出良好的识别性能，精确率为1.0，召回率分别为0.857和0.875，F1分数均为0.923。所有场景的AUC值均高于0.88，其中ST和SE的AUC值分别为0.933和0.995。KNN和SVM模型在区分ST和SE方面的性能显著优于XGBoost模型。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，ML-PCA方法相较于传统和分子沙门氏菌血清分型方法具有多项优势：PCA制造成本低，估计每个3×3阵列成本约为0.30-0.71美元（不含人工），而传统和分子方法的成本估计为10-94美元；PCA可与食品基质一起包装，无需破坏性采样即可实现连续监测；该方法无需富集、培养或其他样品制备步骤。然而，该研究也存在一些局限性：仅评估了ST和SE两种血清型，其普适性有待进一步验证；初始接种浓度（约3 log CFU/g）高于实际供应链中通常遇到的污染水平；检测限尚未确定；KNN和SVM模型的整体检测准确率虽可行但尚不足以用于诊断应用；实验在小型密封培养皿中进行，可能与商业包装系统在包装形式、尺寸、材料和顶空体积等方面存在差异。
研究结论部分指出：本研究开发了一种非破坏性的ML-PCA方法，能够在背景微生物群存在的情况下，对鸡胸肉上的ST和SE进行连续、同步的检测和区分。该方法无需富集、培养或其他大多数现有检测方法所需的样品制备步骤。在测试的三种ML模型中，KNN和SVM模型在识别和区分单一血清型、双血清型和血清型混合物中的ST和SE以及将其与背景微生物群区分开来方面表现出良好性能。ST和SE可在室温条件下2至48小时以及4°C条件下1至7天的整个贮藏期内被识别，准确率为67-88%。此外，ST和SE最早可在室温下6小时和4°C下1天被检测和区分，测试准确率超过80%。ML-PCA方法有望整合到智能包装中，并有可能扩展其应用以监测和区分其他病原体及其相应血清型。未来的工作应进一步扩展检测准确率的提升以及在更多血清型、食品基质和环境条件下的验证，以推动ML-PCA方法在食品供应链中的实际应用。
