pH变化下转谷氨酰胺酶交联酪蛋白胶束乳液的微观结构组织与功能性：来自X射线显微断层扫描的见解

《Food Hydrocolloids》：Microstructural organization and functionality of transglutaminase-crosslinked casein micelle-based emulsions under pH variation: insights from X-ray microtomography

　　

本研究探讨了X射线显微断层扫描（μCT）表征简单乳液模型的潜力，研究对象为在不同pH条件（3.5-9.0）下经转谷氨酰胺酶（TGase）处理的酪蛋白胶束乳液。研究重点在于理解pH诱导的分子重排如何转化为三维微观结构组织和宏观乳液性质。研究人员采用多尺度方法，结合μCT、乳化性和流变学测量，以及蛋白质二级和三级构象的光谱分析。结果表明，pH显著调节蛋白质构象，导致TGase处理的酪蛋白胶束乳液呈现不同的微观结构组织和宏观行为。在天然pH和碱性pH条件下，增强的静电排斥和分子柔性促进了有效的界面吸附，导致更细的液滴分散和更高的乳化活性。相反，在等电点（pH 4.6）附近，广泛的蛋白质聚集导致形成致密且相互连接的微观结构，尽管乳化能力降低，但乳液稳定性增强。此外，所研究的微观结构参数与乳化性能（乳化活性、乳化稳定性和失稳指数）及流变学性质呈强相关性，证实了液滴组织在控制整体乳液行为中的关键作用。此外，这些关系揭示了pH依赖性分子变化直接控制乳液网络的发展和稳定性。这些发现表明，X射线显微断层扫描是表征简单乳液系统中脂肪液滴体积、空间分布、形状和网络组织的强有力且适用的工具，可与更复杂的食品乳液相媲美。该研究为pH如何控制TGase处理的酪蛋白胶束乳液的结构-功能关系提供了新的见解。

**论文解读：pH调控下转谷氨酰胺酶交联酪蛋白胶束乳液的微观结构与功能特性——基于X射线显微断层扫描的多尺度研究**

**一、研究背景与问题提出**

近年来，食品工业对基于蛋白质的功能性配料需求日益增长，这类配料需兼具稳定性、清洁标签和优异性能。蛋白质因其乳化、发泡、凝胶等多种功能特性而被广泛应用于食品配方中。然而，这些功能特性在加工或环境胁迫条件下（尤其是pH、离子强度和温度的变化）往往表现不佳，这促使研究者探索蛋白质修饰策略以改善其结构和功能表现。在众多酶法修饰手段中，转谷氨酰胺酶（TGase）诱导的交联被认为是有效策略之一。TGase是一种来源于微生物的多功能酶，可催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸残基的ε-氨基之间形成共价键。酪蛋白因其柔性结构和氨基酸残基的高可及性，被认为是该交联剂的优良底物。研究表明，TGase处理可显著增强酪蛋白胶束对化学变性、钙螯合和热处理的抵抗性，同时改善其在宽pH范围（2-7）内的稳定性。

尽管已有大量研究关注复杂商业食品体系的微观结构，但基于蛋白质的简单模型乳液仍相对未得到充分探索。特别是，pH诱导的TGase交联酪蛋白胶束分子重排如何转化为乳液微观结构和功能表现，其机制仍不清楚。分子尺度的构象变化如何决定三维液滴组织，以及这种结构化如何控制宏观流变学和稳定性，尚未得到充分阐明。传统表征技术如光学显微镜和光散射方法存在局限性，光学显微镜仅能提供二维图像且深度有限，光散射技术则基于间接测量和对颗粒形状及均匀性的假设。在此背景下，X射线显微断层扫描（μCT）作为一种先进的无损三维结构分析工具，能够基于样品内X射线衰减差异提供高分辨率的三维微观结构表征。基于此，研究人员提出假设：pH诱导的TGase交联酪蛋白胶束构象变化控制液滴组织和网络形成，从而决定所得乳液的乳化性能和流变行为。

**二、研究内容与主要技术方法**

本研究旨在阐明pH诱导的TGase交联酪蛋白胶束构象变化如何影响蛋白质稳定乳液的形成、微观结构组织、流变行为和稳定性。研究采用了多尺度方法，主要涉及以下几个关键技术：（1）X射线显微断层扫描（μCT）：使用Skyscan 1275系统（Bruker公司）在40.0kV和250.0μA条件下扫描样品，像素尺寸为7μm，通过NRecon软件进行断层重建，并使用CT-Analyzer软件定量提取微观结构参数；（2）乳化性能测定：采用激光衍射粒度分析仪测定液滴尺寸分布，使用浊度法测定乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI），并通过离心加速法测定乳析指数（CI）；（3）流变学测量：使用HAAKE MARS III流变仪测定流动行为（剪切速率0.1-400s^-1）和粘弹性（频率扫描），采用Ostwald-de Waele模型和Bohlin理论对数据进行分析；（4）光谱学分析：使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析蛋白质二级结构（酰胺I区1700-1600cm^-1），使用荧光光谱（内源色氨酸和外源ANS探针）分析蛋白质三级结构。样本为8%（w/w）TGase处理酪蛋白分散液与20%葵花籽油制备的水包油（o/w）乳液，pH条件涵盖3.5、4.6、5.5、天然pH（6.94）、8.0和9.0。

**三、研究结果**

**3.1 乳化性能**

乳化性能测定结果显示，pH显著影响TGase处理酪蛋白胶束乳液的乳化行为。液滴尺寸分析表明，在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下，天然pH条件下获得最小液滴尺寸，其次为pH 9.0和8.0；pH 4.6处观察到最大液滴尺寸，表明等电点附近乳化能力降低。絮凝指数（FI）在pH 4.6处达到最高值1.50，而在中性和碱性pH条件下接近1，表明几乎无絮凝发生。浊度法测定的EAI在天然pH处最高（545m²·g^-1），而ESI在pH 4.6处最高，表明乳化活性和乳化稳定性具有相反的pH最适条件。乳析指数在pH 3.5处最高，在pH 8.0处最低，表明强酸条件促进相分离，而碱性条件有利于乳析稳定性。

**3.2 流变学特性**

流变学测量显示，所有pH条件下乳液均呈现剪切变稀行为，符合假塑性流体特征。pH 4.6处观察到最高粘度（252.64mPa·s），一致性指数K值也最高（10.28Pa·s），流动行为指数n最低（0.20），表明该pH下形成高度絮凝和结构化网络。动态振荡测量表明所有样品均以粘性行为为主（G″>G′），pH 4.6处G′和G″值最高。Bohlin理论分析显示，相互作用强度参数A和配位数z在pH 4.6处最高（3.07Pa·s^1/z和3.80），表明该条件下形成高度互连的三维网络结构。相比之下，中性和碱性pH条件下A和z值较低，反映较弱的分子间相互作用。

**3.3 微观结构分析**

X射线显微断层扫描（μCT）结合三维重建分析提供了详细的微观结构信息。二元截面图像显示，天然pH条件下呈现细小、均匀分布的液滴，无明显聚集；pH 3.5条件下结构高度异质，形成松散且不连续的网络；pH 4.6条件下形成致密、紧凑的聚集体，呈现明显的网络结构；碱性pH条件下液滴分散良好，仅有轻微局部聚集。定量参数显示，百分物体体积（POV）在pH 4.6处最高（43.64%），在pH 5.5、天然pH和8.0处最低；物体表面积/体积比（OSVR）在天然pH处最高（77.96mm^-1），表明最细的液滴分散；结构模型指数（SMI）在天然pH处为4.13（接近球形），而在pH 4.6处降至1.03（板状结构）；结构厚度（ST）在各pH间无显著差异；结构分离度（SS）在天然pH处最低（0.14mm）；各向异性度（DA）均接近1，表明脂肪相呈高度各向异性排列。

**3.4 结构变化**

FTIR分析表明，与分散液相比，乳化后蛋白质二级结构发生变化，α-螺旋和无规卷曲含量降低，β-折叠含量略有增加。pH对二级结构具有显著影响：pH 3.5处β-折叠含量最高（46.70%），反映强酸条件下增强的蛋白质聚集和分子间β-折叠形成；pH 5.5处β-折叠含量最低；pH 4.6、天然pH和8.0处含量相当。α-螺旋含量在pH 3.5处最低（6.67%），在pH 8.0-9.0处最高（约8.7-8.8%）。荧光光谱分析显示，乳化后色氨酸和ANS荧光强度均降低，表明界面吸附导致疏水和芳香族残基参与分子间相互作用或被包埋。在乳液状态下，pH 4.6处两种荧光探针的荧光强度最高，伴随轻微蓝移，表明等电点附近形成更紧凑的聚集构象；碱性条件下荧光强度降低伴随红移，反映静电排斥增强和胶束解离。

**3.5 多尺度关系分析**

Pearson相关分析揭示了乳化性能、微观结构、流变学和分子结构参数间的显著关系。EAI与ESI呈负相关（r=-0.71），表明乳化形成和稳定由不同机制控制。ESI与FI呈强正相关（r=0.86），表明液滴聚集有助于网络形成和稳定性增强。流变参数A和z与ESI呈强正相关（r=0.88和0.91），与FI也呈强正相关（r=0.95和0.90），表明一定程度的絮凝有利于结构化网络的形成。微观结构参数方面，EAI与OSVR（r=0.91）和SMI（r=0.90）呈正相关，与SS（r=-0.96）和ST（r=-0.66）呈负相关；ESI与POV（r=0.80）、ST（r=0.85）、SS（r=0.65）和DA（r=0.82）呈正相关，与OSVR（r=-0.85）和SMI（r=-0.87）呈负相关。二级结构方面，α-螺旋含量与乳析指数呈负相关（r=-0.71），β-折叠含量与乳析指数呈正相关（r=0.70），无规卷曲含量与乳析指数呈中等负相关（r=-0.60）。

**四、结论**

本研究提供了pH变化下TGase交联酪蛋白胶束乳液结构-功能关系的全面多尺度理解。X射线显微断层扫描被证明是表征蛋白质基模型乳液三维微观结构的有效无损工具，能够定量分析液滴体积、尺寸、形态、空间分布和网络组织。结果表明，精细分散和均匀的液滴分布与增强的乳化活性相关，而致密和各向异性的液滴网络有助于提高粘弹性和乳液稳定性。pH诱导的TGase交联酪蛋白胶束二级和三级结构修饰改变了分子间相互作用和界面组织，进而转化为不同的三维液滴排列和网络结构。中性和碱性条件通过增强蛋白质柔性、增加活性区域暴露和改善油-水界面吸附促进高效乳化，形成更细更均匀的分散体；而接近等电点的pH条件则促进广泛的蛋白质聚集和液滴絮凝，形成具有增强机械强度和稳定性的致密互连网络。该研究建立了分子结构、微观组织与宏观性质之间的强关联，将X射线显微断层扫描与光谱学和流变学方法相结合，为蛋白质基乳液的稳定化提供了新的机制见解，并为设计具有定制技术功能特性的水胶体系统提供了有价值的框架。该论文发表在《Food Hydrocolloids》。