《Food Bioscience》：Ingredient characterization and preclinical evaluation of a standardized crude hydrolyzed yeast β-glucan preparation (crude-HBGs) derived from insoluble yeast β-glucans: Cerebrovascular outcomes in HFD/STZ-induced diabetic rats
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功能性食品配料的发展需要可重复的加工工艺、成分标准化和生物学相关评估。本研究表征并评估了一种标准化粗水解酵母β-葡聚糖制剂（crude-HBGs），该制剂利用从天然橡胶血清（NRS）中回收的酶混合物（一种未被充分利用的橡胶加工副产品）由不溶性酵母β-葡聚糖制
功能性食品配料的发展需要可重复的加工工艺、成分标准化和生物学相关评估。本研究表征并评估了一种标准化粗水解酵母β-葡聚糖制剂（crude-HBGs），该制剂利用从天然橡胶血清（NRS）中回收的酶混合物（一种未被充分利用的橡胶加工副产品）由不溶性酵母β-葡聚糖制备而成。通过成分、理化、结构和蛋白质相关表征确立了原料身份。成年雄性Wistar大鼠被分配至对照组、对照+crude-HBGs组、糖尿病（HFD/STZ）组、糖尿病+crude-HBGs组和糖尿病+二甲双胍组，并口服治疗八周。研究人员进行了组织学、血管腐蚀铸型扫描电子显微镜、神经元染色以及NF-κB、VEGF和血管生成素-1的比较免疫荧光评估。在所选剂量水平下，每日一次口服crude-HBGs八周与脑血管形态、大脑中动脉直径、毛细血管密度和神经元形态的部分维持相关，同时与未治疗糖尿病动物相比，三种标志物的相对免疫反应性较低。这些发现适用于所给药的成分复杂原料基质，并未确定特定成分的活性、明确的神经血管保护或人类营养相关性。结果提供了初步的原料水平证据，支持crude-HBGs作为候选功能性食品配料的进一步评估。
**论文解读**：
**一、研究背景与科学问题**
随着全球食品体系向可持续方向转型，利用可再生生物资源开发下一代功能性食品配料已成为循环生物经济框架下的重要方向。当前食品配料创新的核心已不再局限于生物活性成分的存在，而更强调可重复的加工工艺、成分一致性、工业可扩展性和产品标准化。在这一技术框架内，不溶性酵母β-葡聚糖（IBGs）因其丰富性、结构稳定性、食品相容性和明确的生物学相关性而成为极具吸引力的可再生碳水化合物原料。然而，其紧密的超分子组织和广泛的分子间氢键显著限制了水分散性、可加工性和在食品体系中的掺入。
天然橡胶血清（NRS）作为天然橡胶乳胶加工过程中产生的主要水相副产品，含有丰富的内源性碳水化合物活性酶，但长期未被充分利用。研究人员此前已建立了利用NRS来源酶混合物将不溶性酵母β-葡聚糖转化为标准化粗水解酵母β-葡聚糖制剂（crude-HBGs）的酶促平台。然而，该标准化原料基质在糖尿病相关脑血管重塑中是否表现出生物学上一致的功能仍属未知。2型糖尿病以持续性高血糖、胰岛素抵抗、氧化应激、慢性低度炎症、内皮功能障碍和进行性脑微血管重塑为特征，共同导致脑血管完整性受损。因此，本研究旨在将可持续配料工程从工艺开发延伸至整合性临床前功能评估。
**二、研究设计与方法概述**
该研究采用了多层面的实验策略。原料制备方面，研究人员利用天然橡胶血清中回收的酶混合物（富含内切-β-1,3-葡聚糖酶，活性为1.28±0.36 U/mL），在pH 4.5、45°C条件下对商业不溶性酵母β-葡聚糖（G90，≥90% β-葡聚糖）进行48小时酶促水解，经乙醇沉淀和真空干燥获得crude-HBGs。成分表征包括高效尺寸排阻色谱（HPSEC）分布分析、酸水解碳水化合物测定、Bradford蛋白测定、总葡聚糖/α-葡聚糖/β-葡聚糖含量测定（Megazyme试剂盒）、近程组成与矿物质分析、1H和13C核磁共振（NMR）波谱分析、Tricine-SDS-PAGE电泳及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质鉴定。体内实验中，35只成年雄性Wistar大鼠（8周龄，220-250 g）被随机分为5组（n=7/组）：对照组、对照+crude-HBGs组（60 mg/kg）、糖尿病（HFD/STZ）组、糖尿病+crude-HBGs组（60 mg/kg）和糖尿病+二甲双胍组（100 mg/kg），口服治疗8周。糖尿病通过高脂饮食（60%热量来自脂肪）联合单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ；35 mg/kg）诱导。研究终点包括脑组织苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色、甲酚紫染色、血管腐蚀铸型/扫描电子显微镜（SEM）以及NF-κB、VEGF和血管生成素-1的免疫荧光评估。
**三、主要研究结果**
**3.1 制备与成分表征**
三个独立生产批次（批号HBGs260211、HBGs230811、HBGs231006）显示出可比较的回收率和成分特征，变异系数（CV）范围为1.31%至7.17%。总葡聚糖（CV=1.31%）、酸水解碳水化合物（1.55%）和β-葡聚糖含量（1.98%）的变异性最低。用于体内研究的批次（HBGs260211）含有17.96% β-葡聚糖和11.55% α-葡聚糖，酸水解碳水化合物占38.99%（w/w），水分7.96%，凯氏定氮估算氮含量/蛋白质当量16.24%，灰分10.68%，未检测到脂肪，按差减法计算的近程碳水化合物含量为65.12%。矿物质中钾和镁含量最高。LC-MS/MS分析鉴定出三个蛋白凝胶区域均与巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）来源蛋白候选物相关，包括几丁质酶相关候选物（A0A6A6MIL0_HEVBR）、HEV1.2（Q6JYQ9_HEVBR）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂（E8Z9H3_HEVBR）。
**3.2 代谢特征**
糖尿病组（DM+HFD、DM+HBGs、DM+Met）在HFD/STZ诱导后表现出空腹血糖升高，超过预设糖尿病阈值。与未治疗糖尿病组相比，crude-HBGs和二甲双胍组在选定时点显示出较低的空腹血糖数值，但差异未达到统计学显著水平。血清脂质谱方面，DM+HBGs和DM+Met组在胆固醇和甘油三酯浓度上数值低于未治疗糖尿病组，但差异无统计学意义。
**3.3 TTC染色模式**
对照组和C+HBGs组脑切片显示相对均匀的红色染色，而DM+HFD组在某些皮质和皮质下区域显示更异质和较弱的TTC染色。DM+HBGs组显示比DM+HFD组更均匀的红色染色，提示线粒体脱氢酶相关染色模式的部分维持。
**3.4 组织病理学变化**
Masson三色染色显示，DM+HFD组表现出血管壁组织不规则、管腔狭窄和结构破坏。crude-HBGs给药与糖尿病大鼠MCA组织学外观的部分改善相关，血管壁保留较好且血管紊乱减少。H&E染色显示，DM+HFD组表现出神经元变性、核固缩、细胞质苍白、神经元周围空泡化和神经元密度降低，而crude-HBGs给药相关的神经元形态改变较未治疗糖尿病大鼠轻。
**3.5 神经元完整性与Nissl体分布**
甲酚紫染色显示，DM+HFD组Nissl染色减少且神经元密度降低，而crude-HBGs处理的糖尿病大鼠比未治疗糖尿病大鼠显示更多的Nissl阳性染色。定量分析证实，DM+HFD组Nissl阳性面积减少，而crude-HBGs或二甲双胍给药后部分维持（p<0.001）。
**3.6 脑血管形态与定量分析**
SEM血管腐蚀铸型分析显示，对照组MCA直径75-80 μm，DM+HFD组减少至50 μm（表明糖尿病条件下血管变窄），crude-HBGs给药增加至55-60 μm，二甲双胍增加至62 μm。毛细血管密度分析显示相似模式，对照组最高，DM+HFD组显著降低，crude-HBGs和二甲双胍均部分改善毛细血管密度。
**3.7 免疫荧光评估**
DM+HFD组在血管结构和邻近实质中显示血管生成素-1、NF-κB和VEGF的相对荧光信号增强。与DM+HFD组相比，DM+HBGs组三种标志物的相对荧光强度均较低，二甲双胍组也显示降低。定量分析证实这些差异具有统计学意义。
**四、讨论与结论**
本研究应被最恰当地解读为标准化粗水解酵母β-葡聚糖制剂（crude-HBGs）的原料水平临床前评估，而非纯化β-葡聚糖的功效研究。其主要贡献在于将不溶性酵母来源碳水化合物原料的温和酶促转化与所得crude-HBGs原料基质的可重复制造和生物学评估联系起来。使用从天然橡胶血清（NRS）中回收的酶混合物增加了循环生物经济维度。研究发现，在HFD/STZ诱导的糖尿病大鼠中，口服crude-HBGs与脑血管形态、神经元完整性以及NF-κB、VEGF和血管生成素-1相对免疫反应性的部分维持相关。这些收敛性观察为互补的血管、组织学、神经元和免疫荧光终点提供了生物学上一致的原料水平临床前证据。然而，由于该制剂代表化学异质原料基质，且未包含并行的IBG、纯化β-葡聚糖或分级组分比较物，观察到的反应不能特定归因于β-葡聚糖、酶促水解或任何提出的分子通路。未来研究需确定成分归属、剂量-反应关系、先进血管形态测量、正交分子验证、原料生物利用度、长期安全性、过敏原表征和受控人体干预，方可考虑营养相关性或健康声明。总之，这些发现支持crude-HBGs作为候选功能性食品配料的持续开发，并展示了可持续酶促生物加工在循环生物经济中未来食品配料创新的更广泛潜力。
