综述：用于L-精氨酸生产的微生物系统代谢工程

《Food Bioscience》：Systems metabolic engineering of microorganisms for L-arginine production

　　摘要
L-精氨酸是一种半必需氨基酸，在食品、饲料和制药行业中需求量很大。微生物发酵已成为其工业规模生产的主要方法。然而，工业微生物菌株的表现仍面临几个关键挑战，如反馈抑制、前体竞争和辅因子失衡，这些限制了进一步的工业规模改进。为了解决这些问题，本综述全面概述了用于微生物生产L-精氨酸的代谢工程策略，重点关注底盘选择、途径优化和系统代谢工程策略。首先，我们总结了用于L-精氨酸生物合成的微生物底盘的生理和代谢特性，包括谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、大肠杆菌（Escherichia coli）和皱褶棒状杆菌（Corynebacterium crenatum）。随后，我们详细讨论了L-精氨酸生物合成途径的独特特性和调控机制，包括线性途径、循环途径和新型途径。此外，我们探讨了系统代谢工程策略，如缓解反馈抑制、增强生物合成途径、阻断降解途径、设计运输系统以及设计生物传感器辅助的高通量筛选方法，并强调了它们在开发高产L-精氨酸的微生物细胞工厂中的成功应用。最后，我们展望了未来的突破方向，包括提高耐受性、优化碳流、利用一碳化合物、AI辅助的菌株设计、基于CRISPR的基因组工程以及多组学整合，为具有工业规模验证和工艺优化的商业L-精氨酸生产提供见解。

引言
L-精氨酸是一种含有胍基的基本氨基酸，广泛应用于食品、制药和化妆品行业（Erez等人，2011；Hou等人，2016；Jobgen等人，2009；McNeal等人，2016）。在生理层面上，L-精氨酸不仅是蛋白质合成的基本构建块，还是关键生物活性分子如一氧化氮（NO）、肌酸和多胺的直接前体（Wang等人，2026）。它参与血管扩张、免疫调节、伤口愈合和激素分泌等生理过程（Krzystek-Korpacka等人，2019；Torsy等人，2025）。全球L-精氨酸市场经历了显著增长，2022年至2024年间年生产能力增加了15,000公吨，以满足增加的需求。2026年的市场规模为9.5888亿美元，预计到2035年将达到18.384亿美元，预测期间复合年增长率为7.5%（Market Growth Reports）。因此，开发高效且可持续的微生物细胞工厂已成为学术界和工业界的共同目标。
目前，微生物发酵已成为L-精氨酸生产的主要方法（Kinoshita等人，2004）。这种方法利用廉价且可再生的资源作为原料，避免了传统蛋白质水解方法所需的高温、强酸和广泛的酸碱中和步骤（Ikeda，2003）。它具有显著的优势，包括温和的工艺条件、低能耗和最小的环境影响，符合绿色生物制造原则。微生物发酵生产L-精氨酸的基石在于通过经典突变和代谢工程获得高产菌株。经典突变提供了一种快速但无方向性的方法来提高L-精氨酸产量。通过产生随机的整个基因组突变，它可以有效地缓解代谢限制，而不需要预先的遗传知识。这使得它成为菌株开发的强大初步策略，特别是在对途径理解不完全的情况下。经典突变，包括随机突变和抗性筛选，已被用于将L-精氨酸滴度提高到约45克/升（Cheng等人，2016）。然而，随机突变导致的代谢负担、遗传不稳定性和副产物形成对进一步菌株优化构成了重大障碍（Cheng等人，2016）。相比之下，基于系统生物学、合成生物学和高通量筛选的代谢工程实现了精确高效的代谢重编程。它已成为构建高产菌株的核心范式，并为L-精氨酸的工业规模生产奠定了坚实基础。目前，工业菌株中的L-精氨酸产量已超过100克/升（最高达到132克/升（Jiang, Wang等人，2023）），包括谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌和皱褶棒状杆菌。由于其生产性能、广泛的代谢工程和与扩大规模过程的相关性，这些工业菌株受到了广泛关注。这些工业菌株展示了互补的宿主和途径特性，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性底盘，以及循环和线性L-精氨酸生物合成途径。值得注意的是，谷氨酸棒状杆菌因其成熟的工业应用和安全特性而受到认可；大肠杆菌因其先进的遗传操作工具和遗传可塑性而受到重视；皱褶棒状杆菌则展示了显著的生产性能以及成功的试点规模发酵。其他微生物宿主在此仅简要提及，因为它们的生产产量相对较低，遗传工具箱开发不足或在扩大规模方面的验证有限。总之，经典突变提供了速度和简单性，但存在不可预测性和多效性；而代谢工程提供了精确性和高生产力，但需要大量的前期知识和构建工作。尽管取得了显著进展，但仍有一些持续存在的挑战阻碍了L-精氨酸生产的进一步改进。首先，关键生物合成酶的反馈抑制限制了L-精氨酸合成途径内的代谢流（Ikeda等人，2009；Zhang等人，2017）。其次，生物合成过程能耗高，受到NADPH和ATP供应不足的限制（Man, Xu等人，2016；Park等人，2014；Zhan等人，2019）。第三，产品的低效输出导致L-精氨酸在细胞内积累，加剧了反馈抑制和渗透压胁迫，而底物摄取不足限制了碳利用和整体生产力（Lubitz等人，2016；Shin & Lee，2014）。第四，生产菌株在工业条件下的稳定性有限，如高渗透压和可变的氧气和氮水平，对细胞活力和生产力产生了不利影响（Guo等人，2017；Huang等人，2022；Xu等人，2009）。由于上述瓶颈是相互关联的而不是独立的，单一基因修饰是不够的。克服这些限制需要多层次的代谢工程策略。因此，对微生物宿主、代谢途径和代谢工程策略的全面评估对于指导未来的L-精氨酸生产菌株开发至关重要。
先前的综述主要集中在L-精氨酸及其衍生物的整体生物合成和调控机制（Shin & Lee，2014）、谷氨酸棒状杆菌的代谢优化策略（Jiang, Sheng等人，2021），或谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌的工程进展（Sheng, He, Xu等人，2026；Wang, Liu等人，2023）上。然而，这些研究通常没有提供不同宿主在生产效率、途径属性、可扩展性和工业适用性方面的广泛比较分析。相比之下，我们的综述扩展了关于L-精氨酸生产微生物细胞工厂代谢工程的先前研究（图1），提供了对谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌和皱褶棒状杆菌在生产性能（如滴度、产量和生产力）、扩大规模性能、食品级适宜性和下游加工方面的比较评估。在此基础上，我们首先总结了用于L-精氨酸生产的微生物宿主及其各自的生物合成途径。然后，我们比较了主要的工业微生物宿主，并分析了关键代谢工程策略在L-精氨酸生产中的具体应用（表1、表2）。此外，我们进行了菌株性能和发酵规模的定量比较，评估了滴度-产量-生产力之间的权衡，并评估了工业应用的可行性。最后，我们讨论了未来的研究方向，包括菌株耐受性的提高、计算机辅助的代谢工程设计、L-精氨酸生物传感器的开发以及一碳来源的利用。

部分摘录
**用于L-精氨酸生产的微生物宿主**
多种微生物宿主可用于L-精氨酸的发酵生产。这些包括天然生产者（例如谷氨酸棒状杆菌和皱褶棒状杆菌）和非天然生产者（例如大肠杆菌）（图2），以及具有独特代谢优势的未被充分探索的物种（例如北京棒状杆菌（C. pekinense）、紫色红曲霉（Monascus purpureus）、黄短杆菌（Brevibacterium flavum）和蓝细菌）。选择和优化生产菌株需要综合考虑多个因素。

**L-精氨酸生产的微生物代谢途径**
微生物L-精氨酸生物合成通过三种不同的途径进行：大肠杆菌中的线性途径（Lu，2006；Shin & Lee，2014）、谷氨酸棒状杆菌中的循环途径（Park等人，2014；Zhan等人，2019；Zhao等人，2022），以及在黄单胞菌属（Xanthomonas spp.）中发现的新型天然途径（Morizono等人，2006；Shi等人，2005）（图3，表3）。这三种途径都包含八个酶步骤，但在途径上存在明显差异。

**L-精氨酸生产的微生物工程策略**
由于两个相互关联的系统瓶颈，微生物中的高效L-精氨酸生物合成仍然具有挑战性。首先，生物合成途径与中心碳代谢存在计量关系。具体来说，L-精氨酸的合成消耗了大量ATP和前体（包括谷氨酸、乙酰辅酶A和草酰乙酸），这些也是生物量形成所必需的。这种耦合造成了内在竞争：向L-精氨酸的流动增加不可避免地会...

**L-精氨酸生产的扩大规模性能**
发酵结果表明，在实验室规模的生物反应器中获得的较高滴度在扩大规模过程中并未始终得到保持。具体来说，在5升规模下，经过基因工程改造的谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌和皱褶棒状杆菌的L-精氨酸滴度分别为112克/升、132克/升和87.3克/升。这些结果强调了这些微生物宿株在严格控制的实验室条件下具有显著的生产能力。

**结论与展望**
L-精氨酸是一种半必需氨基酸，在从动物饲料添加剂到制药中间体的广泛工业应用中发挥作用。毫不奇怪，微生物发酵已成为主导的生产途径，取代了传统的蛋白质水解方法。然而，尽管经过数十年的工程改造，实现高滴度、高产量和低成本的生产仍然是一个重大挑战，这主要是由于其生物合成途径的复杂调控和代谢限制。

**作者贡献声明**
王凌凌：撰写——原始草稿。钱金毅：撰写——审阅和编辑。乔宁：撰写——审阅和编辑。刘国东：撰写——审阅和编辑。丁德阳：撰写——审阅和编辑。单占领鹏：撰写——审阅和编辑。陈秀莱：概念构思。

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

**致谢**
本工作得到了国家自然科学基金（32571712）、江苏省工业合成生物学重点实验室和微生物技术国家重点实验室开放项目基金（M2025-04）的财政支持。
王凌凌|钱金毅|乔宁|刘国东|丁德阳|单占领鹏|陈秀莱
江南大学生物技术学院及工业生物技术重点实验室，中国无锡，214122