溶菌酶浓度诱导的热致凝固蛋白凝胶的相变机制

《Food Hydrocolloids》：Phase transition mechanism of thermotropic-condensation protein gels induced by the concentration of lysozyme

　　

摘要

大分子拥挤如何调节热稳定蛋白质（如溶菌酶（LYS）的相变机制目前仍不清楚。在这项研究中，通过使用多尺度方法（包括流变学、聚集动力学、光谱学和显微镜技术），系统地表征了LYS在加热（90°C）后冷却过程中浓度依赖性的（12%、24%和32% w/w）凝胶化行为。在12%的LYS浓度下，轻微的拥挤导致有限的展开和无效的聚集，硬度仅为0.47 g，储存模量（G′ = 0.58 Pa），系统仍保持液态。在24%的LYS浓度下，适度的拥挤在加热过程中引起显著的预展开，随后冷却触发有序聚集，克服了凝胶化能量障碍，形成了以冷却主导的凝胶，硬度达到34.31 g，G′为52.43 Pa。在32%的LYS浓度下，极度的拥挤在加热过程中就使系统达到了临界聚集状态（G′ = 1836 Pa），冷却进一步强化了网络结构，形成了致密的凝胶（硬度=57.95 g，G′=29678 Pa）。这些发现表明，LYS浓度通过调节分子拥挤来决定凝胶化路径，为设计具有可调性能的基于蛋白质的冷固型凝胶提供了理论基础。

引言

众所周知，煮熟的蛋白清（EW）会发生从液态到固态的相变（或表现出优异的凝胶特性）（Lee等人，2022年）。这种现象主要是由于高温处理下大量变性蛋白质（包括卵清蛋白（OVA）、卵转铁蛋白（OVT）、卵黏蛋白（OVO）和溶菌酶（LYS）的展开、聚集和/或交联（Zang等人，2025年；Hu、Yao等人，2025年）。更具体地说，OVA和OVO被认为是形成EW热凝胶（EW-TG）的关键蛋白质（Liu等人，2024年，2025年），而EW-TG的硬度可能与OVT和LYS有关（Koyama等人，2021年）。

普遍认为，在较高浓度（≥10%）的蛋白质溶液中，当受到高温（70-95°C）引起的热变性作用时，会发生展开、聚集和交联现象（Ma等人，2026年）。当环境温度降到室温以下时，可以实现从液态到固态凝胶的相变，并且凝胶状态能够得到良好维持（Ye等人，2022年）。例如，不透明的热致性蛋白清凝胶的形成主要归因于热变性过程中主要蛋白质分子的疏水相互作用和二硫键的作用（Xue等人，2020年）。

此外，在极端碱性条件下，由于强碱诱导的基质蛋白质分子的展开（或变性）和聚集，蛋白清的凝胶化现象也被广泛报道（Xue等人，2022年）。更具体地说，透明保存型蛋白清冷凝胶的形成主要与二硫键和离子键的化学作用有关（Zhao等人，2016年）。同时，金属离子的渗透可以提供盐桥，减少蛋白质分子表面的负电荷，进一步促进保存型蛋白清冷凝胶的凝胶化（Xue等人，2022年）。

近年来，基于蛋白质的热致性凝胶因其高生物相容性、强烈的活性包封能力、营养价值和吸收性而在医学美容和食品领域得到了广泛应用，相比之下，基于多糖的热致性凝胶则相对较少（Guo等人，2024年）。此外，已有报道称，通过在碱性条件下加热蛋白质并随后加入酸或盐处理，可以制备出热致性凝结凝胶（Lu等人，2024年；Ma等人，2026年）。同时，通过金属离子的协调作用、酶促交联和氧化还原反应，也可以增强基于蛋白质的热致性凝结凝胶的形成（Xue等人，2022年）。

一般而言，可逆热致性凝结凝胶的形成主要归因于明胶溶液中蛋白质分子间氢键的破坏，然后在低温下氢键的重新形成（Ahmad等人，2024年）。除了明胶之外，很少有天然蛋白质具有形成热致性凝结凝胶的潜力。幸运的是，我们之前的研究偶然发现，低浓度的LYS在加热时能保持液态，而高浓度的LYS则倾向于形成热致性凝结凝胶或热变性诱导的凝胶。

因此，假设这种现象可能与蛋白质的热变性和大分子拥挤的共同作用有关（图1）。然而，使用不同浓度LYS制备的热致性凝结凝胶的潜在机制尚未完全阐明。因此，我们对不同浓度（12%、24%和32%）的LYS溶液在加热-冷却循环中的相变进行了表征和量化，其中12%的卵清蛋白作为对照。同时，系统地、全面地研究了聚集状态和动力学、粘弹性行为、水分分布、构象和微观结构，以阐明溶菌酶浓度引起的热致性凝结蛋白质凝胶的相变机制。

章节片段

OVA-12热凝胶和LYS-12/24/32热致性凝结凝胶的制备

简单来说，将12%的OVA、12%和32%的LYS粉末（w/w）分别溶解在88%、88%、76%和68%的去离子水中，或混合均匀，得到不同浓度的蛋白质溶液，分别标记为OVA-12、LYS-12、LYS-24和LYS-32。然后将均匀的原始蛋白质溶液在90°C的水浴中加热30分钟，再冷却至室温（25°C）约30分钟，以生成OVA热凝胶和LYS热致性凝结凝胶。

原始溶菌酶及其在不同浓度（12%-32%）下经过加热-冷却循环后的相态（或外观）

众所周知，蛋白质的浓度显著影响其热变性和凝胶化行为（Dash等人，2024年）。因此，对不同浓度（12%、24%和32% w/w）的溶菌酶（LYS）制备的热致性凝结凝胶进行了加热（90°C加热30分钟）和冷却（至室温30分钟）处理，并观察了其相变过程。

结论

总之，这项研究阐明了溶菌酶浓度通过大分子拥挤效应控制热诱导冷固型凝胶形成的分子机制。在低浓度（12%）下，轻微的拥挤导致碰撞不足和有限的聚集，使系统保持液态。在中等浓度（24%）下，增强的拥挤促进加热过程中的部分展开，并使冷却诱导的有序聚集克服了凝胶化障碍。

CRediT作者贡献声明

Zixiao Li：撰写——原始草案，方法学设计。Bowen Yin：实验研究，数据分析。Yangming Xu：数据分析。Qun Huang：方法学设计，实验研究。Huiwen Zhan：撰写——原始草案，方法学设计。Xiaole Xiang：撰写——审稿与编辑，指导。Shugang Li：撰写——审稿与编辑。

伦理指南

本研究无需伦理批准。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了现代农业594产业技术研究系统（CARS-40-K25）、湖南省芙蓉计划下的科技创新青年人才项目（2026RC3347）以及黔东南 prefecture科技支持计划（8）的财政支持。

Zixiao Li|Bowen Yin|Yangming Xu|Qun Huang|Huiwen Zhan|Xiaole Xiang|Shugang Li

长沙科技大学食品科学与生物工程学院，中国湖南长沙，410114