一种用于监测生牛肉新鲜度的肌红蛋白-琼脂糖凝胶比色指示剂，其对含硫挥发性物质具有响应性：传感机制与应用

《Food Bioscience》：A myoglobin-agarose gel colorimetric indicator responsive to sulfur-containing volatiles for raw beef freshness monitoring: Sensing mechanism and application

　　

摘要

肉类变质过程中产生的含硫挥发性化合物会与肌红蛋白相互作用，并改变其发色团的状态。在本研究中，肌红蛋白被用作基于琼脂糖凝胶的含硫化合物响应指示剂，用于监测生牛肉的新鲜度。研究了该指示剂对不同浓度硫化氢（H₂S）的反应、在不同光照和温度条件下储存生牛肉时的行为、肌红蛋白颜色变化机制以及其在监测生牛肉新鲜度方面的性能。在受控的H₂S暴露下，当H₂S浓度≥150 ppm时，含硫化合物响应指示剂表现出可见的颜色变化。将肌红蛋白掺入琼脂糖凝胶中会导致凝胶网络的结构无序增加，并且热降解过程更加渐进，这可能反映了分子间相互作用的变化。在储存生牛肉的过程中，该指示剂在荧光灯下的颜色变化比在暗处更早出现，并且在4°C、10°C和25°C时表现出温度依赖性的颜色响应。观察到的光谱变化表明，肌红蛋白依次转化为氧合肌红蛋白，然后转化为磺基肌红蛋白，伴随颜色从棕色变为红色，最终变为深绿色。值得注意的是，这种棕色到红色的转变与通常公认的总挥发性碱性氮和总菌落计数的腐败阈值非常吻合。这些发现展示了所开发的含硫化合物响应指示剂作为监测生牛肉新鲜度的比色工具的潜力，其响应反映了变质过程中产生的含硫化合物和储存条件的综合影响。

引言

由于微生物活动、酶自溶、脂质氧化和蛋白质氧化，新鲜肉制品极易变质。因此，严格的质量控制对于确保产品的安全性和新鲜度至关重要（Bekhit等人，2021年）。肉类质量通常通过三种主要方法进行评估：化学分析、微生物分析和感官评估。化学分析（如总挥发性碱性氮（TVBN）和pH值测量）需要样品制备和实验室分析；微生物分析（包括总菌落计数（TVC）需要较长的培养时间；而感官评估则具有主观性，取决于评估者的专业知识（Kuswandi等人，2014年；Kuswandi & Nurfawaidi，2017年）。这些局限性突显了需要一种简单、快速且高效的方法来评估肉类质量（Lee & Shin，2019年）。

最近，能够通过染料颜色变化为消费者提供产品新鲜度简单视觉指示的比色指示剂得到了广泛研究（Gong等人，2026年）。富含蛋白质的食物（如肉类、奶酪和鸡蛋）会随着时间的推移而变质。在变质过程中，蛋白质被腐败微生物酶解，释放出含硫氨基酸，包括半胱氨酸和甲硫氨酸（Kadota & Ishida，1972年）。这些释放的含硫氨基酸随后分解为含硫有机化合物，包括硫醇、甲硫醇、二甲基硫化物、二甲基二硫化物和甲基硫代乙酸酯，最终生成H₂S（Li等人，2021年；Gruenwedel & Patnaik，1971年；Casaburi等人，2015年）。Sukhavattanakul和Manuspiya（2021年）报告称，当猪肉在4°C下储存时，容器内的H₂S浓度从第8天的10.34 ppm增加到第28天的249.76 ppm。当鲤鱼和鸡胸肉在4°C下储存8天时，产生H₂S的细菌数量从鲤鱼的3.47 log CFU/g增加到9.74 log CFU/g，从鸡胸肉的2.13 log CFU/g增加到8.78 log CFU/g（Zhai等人，2019年）。此外，Kim等人（2021年）证实，当鸡腿在4°C下储存9天时，H₂S浓度从0.11 ± 0.05 ppb增加到159.40 ± 241.65 ppb，甲基硫醇从0.13 ± 0.07 ppb增加到240.12 ± 197.73 ppb，二甲基硫化物从0.10 ± 0.05 ppb增加到39.21 ± 48.46 ppb，二甲基二硫化物从3.04 ± 3.70 ppb增加到354.03 ± 257.71 ppb。这些研究表明，猪肉、鲤鱼和鸡肉在储存过程中含硫化合物的增加表明，富含蛋白质的食物的变质与含硫化合物的产生相关。因此，开发一种能够在含硫化合物作用下改变颜色的指示剂可以通过指示剂的可见颜色变化来检测变质。许多研究（Zhai等人，2019年；Teymouri & Shekarchizadeh，2022年；Lin等人，2022年；Li等人，2021年）基于纳米材料（例如银、铜、金和钌）开发了针对鸡肉和猪肉的含硫化合物响应指示剂。然而，纳米材料的潜在毒性和迁移性限制了它们在食品包装系统中的应用（Hoseinnejad等人，2018年；Souza & Fernando，2016年）。相比之下，使用天然色素的含硫化合物响应指示剂的研究仍然有限。

肌红蛋白是一种天然色素蛋白，由一个血红素基团组成，其中铁（Fe）原子位于由四个吡咯环组成的卟啉结构的中心，以及一个球蛋白（Jiang等人，2023年）。当肌红蛋白在氧气（O₂）或过氧化氢（H₂O₂）存在下与硫化合物接触时，肌红蛋白中的铁（Fe）与硫原子结合形成磺基肌红蛋白，从而导致颜色变化（Smolander等人，2002年；Román-Morales等人，2016年）。Smolander等人（2002年）评估了含有天然色素肌红蛋白的新鲜度指示剂对H₂S的响应，并评估了其在鸡肉中的适用性。然而，该研究并未探讨肌红蛋白的颜色变化机制与其结构特征之间的关系。此外，也没有研究该指示剂在不同储存条件（包括光照和温度）下的行为。尽管已知肌红蛋白能与多种含硫化合物反应（álvarez-Armenta等人，2023年），但在实际食品储存条件下基于肌红蛋白的指示剂的响应尚未得到全面研究。因此，需要进一步的研究来阐明它们的响应机制，表征它们对储存条件的依赖性行为，并评估它们在监测生牛肉新鲜度方面的实际适用性。因此，本研究的目的是确定诱导掺有肌红蛋白的琼脂糖凝胶指示剂出现可见颜色变化所需的最小H₂S浓度，评估肌红蛋白掺入对琼脂糖凝胶网络结构和热性能的影响，阐明颜色变化机制，评估4°C和储存温度对生牛肉储存期间指示剂响应的影响，并评估其在4°C和10°C下监测生牛肉新鲜度的适用性。

章节片段

材料

作为比色染料使用了来自马骨骼肌的肌红蛋白（纯度为95–100％，基本上不含盐；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。琼脂糖从Duksan（韩国安山）购买，磷酸二氢钠七水合物、磷酸一氢钠一水合物和0.5 M盐酸溶液（HCl）从Samchun Pure Chemical（韩国平泽）购买。用于新鲜度监测的生牛肉（平底铁扒）和鲭鱼片从E-mart购买。

在H₂S暴露下测定肌红蛋白浓度

选择H₂S作为模型含硫化合物，以表征含硫化合物响应指示剂在受控条件下的内在响应特性。这些实验旨在确定指示剂对单一含硫化合物的响应，以便在其在复杂食品系统中的性能评估之前进行测试。掺有不同浓度肌红蛋白的含硫化合物响应指示剂的ΔE值对各种条件的响应。

结论

本研究探讨了掺有肌红蛋白的琼脂糖凝胶指示剂对含硫化合物的响应特性、颜色变化机制及其在监测生牛肉新鲜度方面的适用性。在受控的H₂S暴露下，该指示剂表现出浓度依赖性的比色响应，结构分析证实了肌红蛋白成功掺入了琼脂糖凝胶基质。在储存生牛肉的过程中，该指示剂表现出

CRediT作者贡献声明

Minyoung Kwak：撰写－原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、数据整理。Sea C. Min：撰写－审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、研究、资金获取、概念化

利益冲突声明

作者声明没有任何利益冲突。

致谢

本研究得到了食品药品安全部（2024年）的资助（项目编号：22193 MFDS468），以及韩国食品、农业和林业技术规划与评价机构（IPET）通过高附加值食品技术开发计划的资助，该计划由农业、食品和农村事务部（MAFRA）提供资金（项目编号：RS-2025-02232975）。

Minyoung Kwak | Sea C. Min首尔妇女大学食品科学与生物技术系，Hwarangro 621号，Nowon-gu，首尔01797，大韩民国