从银杏种子蛋白水解物中发现的靶向 Keap1-Nrf2 通路新型抗氧化肽：结合虚拟筛选、量子化学计算与斑马鱼模型体内验证

《Food Research International》：Novel antioxidant peptides targeting the Keap1-Nrf2 pathway discovered from Ginkgo biloba seeds protein hydrolysate: Combining virtual screening, quantum chemical calculation, and zebrafish models in vivo validation

　　• 首次发现源自银杏种子靶向 Keap1-Nrf2 的新型肽。• 肽与 Keap1 残基之间形成稳定的氢键。• 两种肽通过激活 Keap1-Nrf2 通路增强斑马鱼体内的抗氧化酶。• 提供了一种高效的天然抗氧化剂筛选多方法策略。**引言**近年来，天然来源的抗氧化剂因其高安全性和优异的生物相容性而备受关注，使其成为日常膳食补充的理想选择（Su 等，2024；Zhu 等，2024）。植物来源的抗氧化肽由于其天然安全性、高效性和易吸收性而被广泛应用于各个领域。与动物来源相比，植物来源更加多样，其加工副产品富含可提取蛋白质，使其成为抗氧化肽的主要来源（Zhu 等，2024）。然而，目前关于植物来源抗氧化肽的研究主要集中在大豆和小麦等传统作物上，对于特色植物资源的探索仍存在显著缺口。银杏种子（GBS）被归类为药食同源资源，蛋白质含量为 9%–13%，氨基酸谱均衡，包括多种必需氨基酸，是一种兼具营养价值和发展潜力的高质量植物蛋白资源（Zhou 等，2019；Zhou 等，2020）。据报道，银杏种子蛋白（GBSP）表现出优异的功能特性，显示出作为食品配料的潜力（Deng 等，2011；Liu 等，2021）。在现代食品加工中，银杏因其高营养价值和优异的功能特性而被广泛用作食品配料。它们被添加到面包、饼干、酸奶和乳饮料等产品中，以增强营养组成和质量（Deng 等，2026）。在功能性食品开发中，银杏衍生物的抗菌和抗氧化生物活性使得能够创建功能性口服液、膳食补充剂和益生元早餐粉等健康食品，进一步释放其食用价值（Biernacka 等，2023）。迄今为止，已分离和评估了几种具有不同生物活性（如抗菌（Sawano 等，2007）和抗氧化特性（Huang 等，2010；Zhou 等，2012））的 GBS 衍生分离物。然而，GBSP 表现出致敏性，限制了其应用。为了克服这些局限性，酶解已成为一种有前景的策略。通过使用特定蛋白酶靶向 GBSP 进行蛋白酶解切割，GBSP 被分解为较小的肽片段。这种方法不仅降低了致敏性并增强了稳定性，还提升了功能性（Can 等，2016；Wang 等，2023）。先前的研究表明，某些肽可以通过竞争性结合 Keap1 Kelch 结构域来激活 Keap1-Nrf2 通路，从而发挥抗氧化作用（Jia 等，2025）。Zhao 等（Zhao & Liu, 2023）从豌豆蛋白水解物中分离和纯化出抗氧化肽。他们证明了其体外强大的抗氧化活性，显著减少了 H2O2 诱导的细胞损伤，同时降低了 ROS 和 MDA 水平。分子对接结果表明，这些肽可能通过占据 Keap1-Nrf2 结合位点来发挥抗氧化作用，从而激活 Keap1-Nrf2 信号通路。尽管 GBSP 蛋白是生产食品级抗氧化肽的高质量原料，但负责其抗氧化作用的具体肽段和氨基酸序列尚未被鉴定。目前，功能性食品行业迫切需要安全、可食用且活性明确的天然抗氧化肽（Zaky 等，2021）。GBS 是一种富含蛋白质的粮油原料，兼具药食属性，其抗氧化肽尚未得到系统开发。缺乏对活性肽序列的精确鉴定和对其应用潜力的科学评估，阻碍了 GBS 资源的高值化转化。然而，传统的抗氧化肽发现方法受限于耗时的过程、高成本以及建立定量结构 - 活性关系（SAR）的困难（Qin 等，2023）。肽组学和计算机辅助工具的发展显著增强了在植物蛋白中发现的生物活性肽的筛选、鉴定和生物活性评估。整合多种计算方法形成互补策略，不仅克服了单一方法的局限性，还显著增强了新型肽发现的广度和深度，为功能食品和药物开发提供了强有力的支持（Zhang, Li, Ren, Xiao, & Duan, 2024）。本研究创新性地整合了多维虚拟筛选方法，从 GBSP 水解物中鉴定出两种高活性的抗氧化肽。研究结合了质谱、一维核磁共振（1D-NMR）和分子动力学模拟技术，以确定目标肽的纯度并表征其空间结构。体外自由基清除实验证实这些肽具有直接抗氧化活性。进一步建立 H2O2 诱导氧化应激的斑马鱼体内模型，结合 qPCR 和 Western blot 蛋白定量，研究系统性地证明了目标肽通过特异性激活 Keap1-Nrf2 抗氧化信号通路发挥体内抗氧化保护作用。本研究旨在以 GBSP 为原料，开发安全、可食用、高抗氧化的食品来源天然抗氧化肽。阐明其抗氧化活性和作用机制，将为 GBSP 资源的高值化利用和功能性食品的开发提供理论依据和技术支持。**章节摘要****材料和化学品**合成肽由南京肽生物科技有限公司（中国南京）合成；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自 TCI（上海）发展有限公司（中国上海）；2,2′-联氮 - 双 (3-乙基苯并噻唑 -6-磺酸)（ABTS）、谷胱甘肽（GSH）和 BCA 蛋白质测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（中国北京）；2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自美国 GlpBio；**GBS 肽组学分析**银杏肽组鉴定结果产生了 552 种源自 36 种蛋白质的肽，详见表 S1。这些肽主要由 7–15 个氨基酸的短序列组成，占所有鉴定肽的 92.9%。相比之下，超过 16 个残基的肽仅占 1.4%（图 1A）。在选择的 64 种用于对接的肽中，68.8% 的分子量低于 1.5 kDa（图 1B）。先前的研究已证实所有高潜力的抗氧化肽**结论**本研究调查了从 GBS 分离和纯化的肽的结构特征及其对斑马鱼氧化应激损伤的保护作用。通过分子对接和动力学模拟的综合分析，发现 LR-7 和 IR-8 通过激活 Keap1-Nrf2 通路显著缓解氧化stress。分子对接筛选出两种新型肽 LR-7 和 IR-8，结合能分别为 -7.8 和 -8.2 kcal/mol。两者**动物对象**本研究按照 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经南京中医药大学批准。（批准号：202604A028）**CRediT 作者贡献声明****姚梦茹：** 撰写 – 原稿，可视化，软件，形式分析，数据整理。**张宇浩：** 撰写 – 原稿，验证，软件，形式分析，数据整理。**杨彩静：** 数据整理。**李通：** 数据整理。**刘海益：** 数据整理。**赵艺云：** 数据整理。**麦萨吾尔·木土敏：** 数据整理。**郭胜：** 监督，资源。**段金鳌：** 资源，经费获取。**肖平：** 撰写 – 审查与编辑，监督，项目管理，经费**伦理声明**所有动物实验程序均经南京中医药大学动物福利与伦理委员会批准（批准代码：202604A028），并严格按照 ARRIVE 指南和国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》执行。**资助**本工作得到了《国家重点研发计划》（2025YFC3509100）；《江苏省高校基础科学（自然科学）研究重大项目》（24KJA360007）；《中药与林业工程交叉创新研究院交叉项目》（LYZYXMA-202605）；《南京中医药大学中医药一级学科“领航计划”科研项目》（ZYXYL2024-001）；高水平重点学科**竞争性利益声明**作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本论文报告的工作。姚梦茹 | 张宇浩 | 杨彩静 | 李通 | 刘海益 | 赵艺云 | 麦萨吾尔·木土敏 | 郭胜 | 段金鳌 | 肖平