《Food Research International》：Temporal dynamics and metabolic potential of microbial dark matter during dry storage of high-temperature Daqu revealed by metagenome-assembled genomes
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•在高温大曲中发现了五种新型未培养的微生物暗物质谱系（主要为Bacillota门）。••MDM基因组编码了丰富的CAZymes和新型生物合成基因簇。•葡糖淀粉酶活性与MDM群落的动态变化存在一定的关联。引言高温大曲是江南风味白酒生产中的主要糖化发酵剂和风味前体的重要来源（Jin
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在高温大曲中发现了五种新型未培养的微生物暗物质谱系（主要为Bacillota门）。
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•MDM基因组编码了丰富的CAZymes和新型生物合成基因簇。
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葡糖淀粉酶活性与MDM群落的动态变化存在一定的关联。
引言
高温大曲是江南风味白酒生产中的主要糖化发酵剂和风味前体的重要来源（Jin et al., 2017）。发酵后的干燥储存（成熟过程）是不可或缺的制造步骤，它重塑了微生物群落结构，稳定了水解酶的活性，并推动了美拉德反应和风味化合物的积累，这些因素直接决定了成品大曲的酿造性能和感官品质（Chen et al., 2026; Dong et al., 2024; Yang et al., 2024）。因此，解析大曲微生物群落的组成、功能特征和动态变化机制对于理解白酒酿造原理和指导精准品质调控至关重要。
早期对大曲微生物群落的研究主要依赖于16S rRNA基因扩增子测序。这种方法系统地描述了Bacillus、Kroppenstedtia和Thermoascus等核心类群，并绘制了它们在发酵和储存阶段的时间动态变化图（Gan et al., 2019; Zhu et al., 2022）。然而，这种方法本质上仅限于属级别的分类分辨率，无法揭示个体谱系的基因组特征和精细代谢潜力——尤其是那些占大曲群落相当大比例的未培养类群（Zhu et al., 2023）。
最近应用基因组解析的宏基因组学技术将大曲微生物学研究从成分分析推进到了功能基因组学解析和品质关联分析。对中国七个省份大曲的比较宏基因组学研究揭示了微生物群落的区域差异，并预测了包括氨基酸和香气化合物代谢途径在内的代谢功能（Zhu et al., 2023）。进一步的研究表明，环境因素如温度会影响微生物群落的组装，并在大曲生产和储存过程中驱动特征性风味化合物的形成（Wu et al., 2023）。综合多组学研究还将微生物群落结构和功能基因谱的变化与酱香大曲的感官香气等级差异联系起来，识别出与大曲品质差异相关的关键微生物类群和挥发性标记物（He et al., 2025; Huang et al., 2026）。尽管如此，现有的大曲宏基因组学和多组学研究主要集中在高温发酵阶段，而那些在干燥储存阶段持续存在的未培养谱系仍然大部分尚未得到描述（Li et al., 2023）。
微生物暗物质（MDM）指的是那些缺乏密切相关的培养代表且功能潜力知之甚少的绝大多数微生物谱系，它们构成了自然和工程生态系统中的大部分微生物多样性（Nayfach et al., 2021）。越来越多的宏基因组学调查显示，发酵食品生态系统中蕴藏着丰富的新型MDM谱系，这些谱系具有特殊的次级生物合成和碳水化合物利用能力，代表了在发酵优化和产品质量提升方面具有潜在应用价值的未充分探索的微生物资源（Du et al., 2023; Wang et al., 2023）。随着宏基因组分箱技术的进步，大规模研究从全球多样的发酵食品样本中重建了数百个非冗余的宏基因组组装基因组（MAGs），大大扩展了与食品相关的微生物组基因组目录（Du et al., 2023）。尽管取得了这些进展，但大多数关于发酵食品中MDM的研究仍停留在群落水平多样性和总体功能预测阶段，而那些在干燥储存阶段持续存在的未培养谱系仍基本未被研究（Li et al., 2023）。
在高温大曲系统中，扩增子和宏基因组学调查反复报告了大量未分类的细菌谱系的存在，这表明大曲微生物群落中有相当一部分在分类学和功能上尚未得到充分描述（Zhu et al., 2023）。早期的非培养依赖研究证明，不可培养的微生物参与了大曲成熟过程中的关键生态过程，例如多物种生物膜的形成，这有助于群落的稳定性和抗逆性（Fan et al., 2020）。随着基因组解析宏基因组学的广泛应用，最近的一项研究成功从高温大曲中分离并描述了一种新型未培养的Pseudogracilibacillus amylolyticus物种，提供了对大曲生态系统中单一未培养类群的首个基因组见解（Lv et al., 2025）。然而，现有的关于大曲微生物群组的基因组解析研究主要集中在高温发酵阶段。据我们所知，还没有研究系统地在整个干燥储存期间全面分离和描述MDM谱系。这些未培养谱系的分类状态、适应性基因组特征、时间动态变化模式及其与环境的相关性仍然大部分不为人知，这阻碍了对大曲成熟过程中微生态机制的全面理解。
在这项研究中，我们对在6个月干燥储存期间收集的高温大曲样本进行了基因组解析的宏基因组学分析。我们重建了非冗余的宏基因组组装基因组（MAGs），鉴定出了新型微生物暗物质（MDM）谱系，并系统地描述了它们的分类状态、适应性基因组特征、时间动态变化模式及其与环境的相关性。本研究旨在填补大曲干燥储存期间未培养谱系基因组描述的空白，扩展大曲微生物组的基因组目录，并为进一步的机能探索和精准品质调控提供基础资源。
章节摘要
采样、DNA提取和宏基因组测序
高温大曲样本来自中国贵州仁怀市景牌茅台镇酒业有限公司的三个独立储存仓库，这些仓库采用了一致的储存协议，分别称为仓库A、B和C。大曲转入干燥储存的那一天定为第0个月，采样从第0个月持续到第6个月，每次采集的时间偏差在±3天内。
在每个采样时间点，选取了七个采样位置
在宏基因组测序、从头组装和基因组分箱之后，从大曲储存样本中重建了52个非冗余的宏基因组组装基因组（MAGs）。所有MAGs均符合中等到高质量标准（完整性≥50%，污染率<10%），符合已建立的MAGs共识标准（Bowers et al., 2017；图1A），基因组完整性范围为50.2%至99.7%，污染率范围为0%至9.8%（图1A，表S3）。
讨论
微生物暗物质（MDM）指的是那些在公共数据库中缺乏密切相关培养代表的未培养微生物谱系，它们构成了全球生态系统中的大部分微生物多样性，仍然是一个尚未充分利用的基因组资源（Nayfach et al., 2021）。近年来，MDM的存在和功能潜力逐渐受到传统发酵食品系统的关注，但它们在江南风味大曲中的基因组特征和生态作用仍
结论
总之，本研究从六个月干燥储存期间的大曲样本中重建了52个非冗余的宏基因组组装基因组（MAGs），其中鉴定出了五种新型微生物暗物质（MDM）谱系，包括四种属于Bacillota门的细菌和一种古菌，这些谱系在分类学上具有显著的新颖性。比较基因组分析显示这些MDM谱系与主要可培养类群之间存在明显的功能差异
在准备这项工作时，作者使用Doubao工具帮助提取和组织来自作者数据集的信息，开发用于可重复数据可视化的R脚本，以及对手稿的英文润色。使用该工具后，作者审查并核实了所有输出与原始实验数据的一致性，根据需要编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。
余志海：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，项目管理，方法学研究，资金争取，数据管理，概念构建。王万松：撰写——初稿，数据可视化，软件使用，资源管理，方法学研究。陈凡：项目管理，方法学研究，数据分析。李连：监督，资源管理，方法学研究。罗立环：方法学研究，数据分析。钟晓芳：方法学研究，数据分析。刘登辉：
资助
本研究得到了贵州省科学技术部（KXJZ [2024] 021）的资助。
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
我们感谢景牌茅台镇酒业有限公司提供的储存场地支持和采样协助，以及来自贵州工业技术学院功能酵母实验室的董万金、陈秋宇、李莉、吴长勋和黄炳轩在样本收集和相关实验工作方面的帮助。
余志海|王万松|陈凡|李连|罗立环|钟晓芳|刘登辉|唐伟元|刘晓辉|黄明亮
