《Acta Neuropathologica》：Distinctive properties of the prion protein in the brain and retina in the amyloidosis associated with the PRNP F198S mutation
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摘要
朊蛋白（Prion protein，PrP）以弥漫性和核心型斑块形式沉积，见于携带PRNP F198S突变的Gerstmann–Str?ussler–Scheinker病（GSS）患者大脑的大部分灰质区域；然而，视网膜中的PrP沉积尚未被表征。此外，也
摘要
朊蛋白（Prion protein，PrP）以弥漫性和核心型斑块形式沉积，见于携带PRNP F198S突变的Gerstmann–Str?ussler–Scheinker病（GSS）患者大脑的大部分灰质区域；然而，视网膜中的PrP沉积尚未被表征。此外，也尚未开展GSS中脑与视网膜PrP沉积的比较分析。研究人员假设脑与视网膜中的PrP聚集和播种（seeding）特性存在差异。本研究旨在分析来自同一家系、均为PRNP F198S突变携带者的GSS患者的脑与视网膜中的PrP。采用神经病理学和生物化学方法（包括实时震动诱导转化实验，Real-Time Quaking Induced Conversion assay，RT-QuIC）对患者的死后组织进行分析。研究发现，视网膜中的PrP沉积仅见于外丛状层（outer plexiform layer，OPL），不具有淀粉样蛋白的染色特性，且能被九种识别PrP序列不同表位的抗体免疫标记。生物化学分析显示，视网膜中的PrP_F198S部分去污剂不溶，组装成大尺寸聚集体，并具有播种活性。此外，视网膜中全长PrP的糖基化程度较对照PrP更为复杂。与脑组织匀浆不同，视网膜匀浆中不含8 kDa PrP内部片段（PrPIF）；然而，经蛋白酶K（proteinase K，PK）处理可在实验条件下生成PrPIF。总之，研究人员首次报道了携带PRNP F198S个体视网膜中PrP的神经病理学和生物化学特性，并将其与同一批个体脑中的PrP特性进行了比较。在GSS F198S中，PrPIF仅组成性存在于脑内，这一事实提示有必要明确视网膜与脑之间是否存在蛋白水解机制的差异。
论文解读：PRNP F198S突变相关GSS中脑与视网膜PrP沉积的差异性研究
一、研究背景与科学问题
Gerstmann–Str?ussler–Scheinker病（GSS）是一种成年起病的常染色体显性遗传性朊蛋白（prion protein，PrP）淀粉样变性，由PRNP基因突变引起。其中，第198位密码子TTC至TCC的错义突变导致苯丙氨酸被丝氨酸替代（F198S），形成GSS F198S变异型。该变异型在一个大家系中已被广泛研究，具有高度外显率，临床表现为行为改变、认知障碍、小脑性共济失调、帕金森综合征及锥体束征。既往神经病理学研究显示，GSS F198S脑中存在两类错误折叠蛋白的聚集：细胞外PrP斑块（含单中心或多中心淀粉样核心）和神经元内3R/4R tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结。蛋白质测序和免疫印迹分析已证实，脑内PrP斑块核心由PrP的N端和C端截短片段构成，其中8 kDa内部片段（PrP internal fragment，PrPIF）及其多聚体是淀粉样核心的主要组分。
尽管视网膜作为中枢神经系统（CNS）的发育性外部组成部分，在多种神经退行性疾病中已被认为可作为“观察大脑的窗口”，但GSS中视网膜PrP沉积的病理特征此前从未被系统表征。在克雅氏病（Creutzfeldt–Jakob disease，CJD）中，PrP聚集体可见于视网膜内丛状层和外丛状层（OPL和IPL），而GSS视网膜的PrP沉积模式尚属未知。此外，脑与视网膜这两个CNS区域在结构组织、突触连接、生理生化特性上存在显著差异，PrP聚集和播种机制是否在不同脑区之间有所不同，是一个关键的病理生物学问题。基于此，研究人员提出假设：GSS F198S中脑与视网膜的PrP聚集和播种特性存在差异。本研究旨在通过对来自同一家系的八名GSS F198S突变携带者的脑和视网膜组织进行系统的神经病理学和生物化学分析，首次阐明视网膜PrP沉积的形态学、分布、生化特性及播种活性，并与同一批个体脑中的PrP病理进行直接比较。
二、主要技术方法
研究人员采用多学科方法对来自同一印第安纳州家系的八名GSS F198S突变携带者（A–H，死后尸检间隔5–18小时）的脑和视网膜组织进行分析，并纳入一例GSS A117V患者的视网膜作为遗传性PrP淀粉样变性的比较样本；阴性对照包括一例阿尔茨海默病（AD）和一例路易体痴呆（DLB）患者的脑和视网膜组织，阳性对照为一例散发型CJD（sCJD，MM/1型）患者的脑和视网膜组织。主要技术方法包括：（1）神经病理学检查：采用苏木素-伊红（H&E）、luxol fast blue（LFB）、硫黄素S（thioflavin S）染色以及两种发光共轭寡噻吩（LCOs：pFTAA和HS-84）荧光配体检测蛋白聚集体；（2）免疫组织化学：使用九种识别PrP全序列不同表位的抗体（PrP 23–40、58–71、90–102、95–108、1E4、3F4、12F10、151–165、220–231）以及针对tau、Aβ、α-突触核蛋白、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、钙结合蛋白（Calbindin）和突触素（synaptophysin）的抗体；（3）免疫荧光共聚焦显微镜：使用Ctbp2（带状突触标记物）、PKCα（视杆双极细胞标记物）和Iba-1（小胶质细胞标记物）进行共定位分析；（4）生物化学分析：包括去污剂可溶/不溶组分分离、蔗糖梯度沉降、蛋白酶K（PK）抗性试验、SDS-PAGE和二维电泳（2D-PAGE）免疫印迹分析；（5）实时震动诱导转化实验（RT-QuIC）：分别使用仓鼠重组PrP（rPrPSen 23–231、90–231）和bank vole重组PrP（rPrPSen 90–231 V109M）作为底物，测定脑和视网膜样品的PrP播种活性，并通过Spearman-K?rber分析估算50%孔位阳性的播种剂量（SD50）。
三、研究结果
（一）视网膜的组织病理学和免疫组织化学研究
在七名GSS F198S突变携带者（A–G）的视网膜中，PrP免疫阳性珠状沉积物仅见于外丛状层（OPL），在角膜、巩膜、晶状体、虹膜、睫状体、脉络膜和视神经中均未检测到PrP免疫阳性。这些珠状沉积物在硫黄素S和LCOs（pFTAA、HS-84）制备中均不显示荧光，表明其不具有淀粉样蛋白的染色特性。使用九种识别PrP全序列不同表位的抗体均能标记这些沉积物。定量分析显示，D和E患者中3F4免疫标记的珠状沉积物平均直径为7.75 μm（±1.93 μm），平均周长为30.55 μm（±6.49 μm），平均面积为52.04 μm2（±23.40 μm2）。在GSS A117V病例中，12F10抗体也在OPL中检测到免疫阳性珠状沉积物，同样不具有淀粉样荧光特性。AD和DLB对照视网膜中PrP免疫反应为阴性。tau、Aβ、α-突触核蛋白和TDP-43抗体未标记任何视网膜层。
（二）PrP与视网膜细胞标记物的共定位
共免疫染色显示，PrP珠状沉积物定位于OPL中视杆双极细胞树突和带状突触所在的区域。PrP与带状突触标记物Ctbp2共定位，表明PrP集中于感光细胞与水平细胞和双极细胞树突形成突触连接的区域；PrP与视杆双极细胞标记物PKCα也显示共定位。PrP与Iba-1标记的小胶质细胞之间未观察到共定位，且无胶质增生和小胶质细胞活化的证据。
（三）脑的组织病理学和免疫组织化学研究
在GSS F198S突变携带者中，大脑半球冠状切片显示半卵圆中心白质苍白，提示髓鞘纤维丢失。大脑皮层和皮层下核团中存在PrP和tau免疫阳性沉积物，但外侧膝状体（LGN）未见tau和PrP沉积。PrP沉积包括单中心和多中心斑块及弥漫性沉积，其中斑块核心在硫黄素S制备中具有荧光（即具有淀粉样性质），而周围弥漫性沉积不具荧光。斑块核心可被表位位于80–150残基之间的抗体标记，而斑块周边仅被针对PrP N端和C端的抗体标记。小脑皮层严重受累，存在大量PrP免疫阳性淀粉样斑块，但小脑皮层和 cerebellar nuclei 中无tau免疫阳性。Aβ免疫阳性见于PrP核心周围，但无独立的Aβ斑块。LCOs（HS-84和pFTAA）在小脑中发现围绕斑块核心的荧光，与Aβ免疫组化结果一致。定量分析显示，小脑皮层分子层和额叶皮层的PrP负担（PrP burden）平均分别为组织面积的35.5%和16.9%。小脑皮层分子层中斑块的平均直径（175.02 μm）和核心面积（785.09 μm2）均大于额叶皮层（分别为148.46 μm和477.48 μm2）。
（四）脑和视网膜中去污剂可溶和不溶PrP的生化表征
免疫印迹分析显示，脑和视网膜的S2（去污剂可溶）组分中均存在35、30和27 kDa三条主要PrP条带，分别对应二糖基化、单糖基化和未糖基化的全长PrP。然而，视网膜中PrP条带模式与脑不同，其特征为35至30 kDa之间界限不清的条带以及一条25 kDa的宽条带，后者在脑中未检测到。在P3（去污剂不溶）组分中，脑和视网膜的PrP糖基化模式相似，但仅在脑中检测到20和8 kDa条带（在过度曝光后可见）。PNGase F处理后，脑和视网膜的S2和P3组分中PrP均还原为单一的27 kDa主条带。使用6H4抗体（识别144–152表位，不识别8 kDa PrPIF）的分析表明，在脑中，S2组分含98%的6H4阳性PrP，P3组分仅含2%；而视网膜中6H4阳性PrP在S2和P3中分别为49%和51%（与3F4检测结果类似）。这一结果明确说明，脑中去污剂不溶的PrP主要由PrPIF及其多聚体构成，而视网膜中则不然。此外，与对照视网膜相比，GSS F198S视网膜中高度糖基化的35–30 kDa PrP条带显著增强，表明F198S突变与PrP糖基化水平升高相关。
（五）蔗糖梯度沉降分析PrP聚集体大小
蔗糖梯度离心分析显示，脑匀浆中的PrP分布于所有梯度组分，但在顶部（组分1–5，含最小聚集体）和底部（组分8–10，含最大聚集体）更为集中；8 kDa PrPIF条带仅在底部组分的过度曝光后可见。相比之下，视网膜中的PrP分布更为局限，仅在顶部（1–2）和底部（8–10）组分中检测到。在顶部组分中，视网膜PrP呈现30–35 kDa的拖尾和25 kDa宽条带；在底部组分中，PrP仅表现为35和30 kDa两条带，25 kDa条带缺失。这表明视网膜中的PrP聚集体主要由去污剂可溶的25 kDa片段（顶部）和去污剂不溶的全长糖基化PrP大聚集体（底部）组成。
（六）RT-QuIC播种活性分析
使用bank vole重组PrP底物（rPrPSen 90–231 V109M）在55°C条件下进行的RT-QuIC实验显示：脑匀浆在10??稀释度于75小时出现阳性信号，且在10??稀释度仍可检测到播种活性（延迟期为95小时）；视网膜样品在10?2稀释度于55小时出现阳性信号，10??稀释度于110小时出现阳性信号，但10??稀释度未检测到播种活性。终点稀释分析显示，脑组织的SD50为7.25 log10 SD50/mg组织，视网膜样品的SD50为5.25 log10 SD50/μL样品，表明视网膜中的PrP播种活性比脑低至少2个log10。使用仓鼠rPrPSen底物的实验未检测到播种活性，AD和DLB对照样品在140小时内无播种反应。
（七）蛋白酶K抗性及8 kDa内部片段的生成
在PK处理实验中，脑和视网膜的S2组分中均未检测到PrPres；在P3组分中，脑的PrPres量显著高于视网膜。脑组织中PrPres呈现为弥散拖尾，伴25、16和8 kDa三条带；视网膜中可见30、25和8 kDa三条弱带。动力学分析显示，在额叶皮层中，随PK消化时间延长（5–40分钟），35–25 kDa条带逐渐减少，8 kDa条带逐渐增加；在视网膜中，虽然初始状态下不存在8 kDa条带，但经PK处理5分钟后即出现8 kDa条带并随时间逐渐增加。这表明PK消化可在视网膜中从头（de novo）生成8 kDa内部片段。
（八）2D-PAGE分析PK抗性PrP的组成
2D-PAGE分析显示，额叶皮层中的PrPres由多个等电点（pI）约9.0、分子量为8 kDa及约16–35 kDa的斑点组成，分别对应PrPIF的单体和多聚体；视网膜中的PrPres则分离为单个pI约9.0、分子量8 kDa的强斑点，对应PrPIF单体。与SDS-PAGE中可见的30、25和16 kDa弱带相比，2D-PAGE的高浓度尿素处理使视网膜中的PrPres条带解离为8 kDa单体，而脑中则保留多聚体。
四、讨论与结论
本研究首次系统描述了GSS F198S中视网膜PrP的神经病理学和生物化学特性，并将其与同一批患者的脑组织进行了直接比较。研究结果表明：（a）GSS F198S视网膜中的PrP沉积不具有淀粉样蛋白的染色特性，与脑中斑块核心的淀粉样性质形成鲜明对比；（b）GSS F198S和GSS A117V中PrP聚集体均仅见于OPL；两种LCOs证实视网膜PrP沉积不具有淀粉样性质；（c）在GSS F198S小脑的LCOs制备中，斑块核心可见但不具荧光，而在GSS A117V新皮层中斑块核心具有荧光，提示不同突变型中淀粉样纤维的折叠构象可能不同；（d）沉积物位于感光细胞与其他视网膜细胞形成突触连接的区域内；（e）PrP 8 kDa内部片段在脑中为组成性存在，但在视网膜中不存在；经PK消化可在视网膜中从头生成该片段；（f）视网膜中的PrP由全长PrP、C1和C2 C端片段以及一条脑中不存在的25 kDa C端糖基化片段组成；（g）视网膜中PrP聚集体的尺寸分布与脑不同，且播种活性低于脑。
这些发现揭示了CNS不同区域中PrP聚集机制的显著差异。脑内PrPIF的组成性生成被认为是淀粉样斑块核心形成的关键步骤，而视网膜中缺乏这种组成性蛋白水解加工，可能是其PrP沉积无法形成淀粉样结构的重要原因。研究人员推测，脑中可能存在某种PK样蛋白水解因子，而视网膜中缺乏该因子。此外，血脑屏障与血视网膜屏障的差异、区域基因表达差异以及局部细胞和分子环境的差异，均可能参与调控PrP在不同CNS区域的聚集命运。这项研究为理解常染色体显性遗传性朊蛋白病的区域性发病机制提供了重要基础，并提示视网膜中富含突触的OPL区域中非淀粉样PrP聚集可能干扰突触传递功能。未来需要通过系统的视网膜电图（ERG）和光学相干断层扫描（OCT）研究来评估这些发现的临床诊断价值，并需通过冷冻电镜（cryo-EM）研究确定GSS F198S视网膜中是否存在PrP纤维及其结构特征。此外，GSS A117V新皮层斑块对LCOs的荧光阳性提示不同PRNP突变可能产生不同构象的淀粉样纤维，这一发现对于理解朊病毒构象株与病理表型之间的关系具有重要意义。
