《Translational Neurodegeneration》：HSPA8 orchestrates SNARE complex assembly to drive extracellular vesicle-mediated spread of p-tau217 in Alzheimer's disease
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背景：阿尔茨海默病（AD）中多泡体（MVBs）的失调通过细胞外囊泡（EVs）导致异常tau分泌，这可能解释了先前观察到的矛盾现象，即血浆中游离形式p-tau217水平升高而p-tau217? EVs减少。本研究旨在探讨p-tau217? EVs减少的机制，以发
背景：阿尔茨海默病（AD）中多泡体（MVBs）的失调通过细胞外囊泡（EVs）导致异常tau分泌，这可能解释了先前观察到的矛盾现象，即血浆中游离形式p-tau217水平升高而p-tau217? EVs减少。本研究旨在探讨p-tau217? EVs减少的机制，以发现AD治疗靶点。方法：通过整合人脑海马空间转录组学与脑脊液EV蛋白质组学，研究人员鉴定了p-tau217? EV释放的关键调控因子。随后，研究人员研究了p-tau217? EVs合成和分泌的机制，并通过shRNA敲低和合成肽干扰在Aβ42处理细胞和AD模型小鼠中系统评估了候选蛋白的调控作用。结果：热休克蛋白家族A成员8（HSPA8）被鉴定为EV生物发生和释放的关键调控因子，介导Aβ–SNAP29相互作用以破坏SNARE复合体组装并损害p-tau217? EV分泌。在AD模型中，用shRNA抑制HSPA8恢复了p-tau217? EVs并改善了认知功能。此外，用针对HSPA8的选择性肽抑制剂阻断Aβ–SNAP29相互作用逆转了p-tau217? EV和认知缺陷的下降。结论：这些发现揭示了HSPA8在调控MVB介导的EV释放和tau传播中的作用，并强调HSPA8是修饰AD进展的有前景的治疗靶点。
论文解读文章：
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，临床上以进行性认知障碍为特征，病理上表现为淀粉样蛋白-β（amyloid-beta, Aβ）斑块和过度磷酸化的神经原纤维tau缠结。尽管Aβ沉积长期被视为关键病理标志，但越来越多的证据表明tau病理与神经元功能障碍和认知损害的相关性更密切，提示tau是疾病进展的核心驱动因素。然而，tau的加工、运输和细胞间传播机制尚不完全清楚，这极大限制了疾病修饰疗法的开发。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）已成为中枢神经系统细胞间通讯的重要介质，并参与包括tau在内的病理蛋白传播。EV的生物发生受内体系统严格调控，尤其是多泡体（multivesicular bodies, MVBs），其控制腔内囊泡的形成和释放。MVB功能障碍可通过至少两种机制促进AD病理蛋白传播：一是溶酶体融合受损导致MVB生成的Aβ42异常分泌；二是自噬体融合缺陷导致tau选择性积累到腔内囊泡中用于跨神经元传递。此外，MVB来源的EVs携带受损DNA可加剧神经炎症。尽管有这些进展，调控EV介导tau分泌的分子机制仍不明确。近期生物标志物研究已将磷酸化tau物种，特别是p-tau217，确立为血浆和脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中AD病理的敏感指标。值得注意的是，虽然AD血浆中游离形式p-tau217水平升高，但先前研究发现p-tau217? EVs的比例反而降低，这一矛盾现象提示EV生物发生或货物装载存在疾病相关改变，指向一个尚未被认识的调控机制。
研究人员开展这项研究，旨在整合人脑海马空间转录组学与CSF EV蛋白质组学，探究AD中p-tau217? EV分泌受损的分子机制，并评估靶向该通路对AD治疗干预的潜力。通过差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）的GO和KEGG富集分析，以及蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析，研究确定了热休克蛋白家族A成员8（HSPA8）作为关键候选调控因子。研究进一步通过Aβ42处理的SH-SY5Y细胞模型和AD模型小鼠（APP/PS1和5×FAD），结合shRNA敲低、合成肽干扰、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、免疫荧光共定位和纳米流式细胞术等实验手段，系统验证了HSPA8在p-tau217? EV合成和分泌中的作用，并评估了遗传沉默和肽抑制剂对认知功能和病理变化的影响。此外，研究还建立了体外血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）模型，以评估EVs从CNS到外周血的转运能力。
研究人员首先排除了外周转运受损的可能性。通过体外三细胞BBB模型，发现Aβ42处理条件下p-tau217? EVs穿越BBB的比例反而显著升高，表明AD中外周血p-tau217? EVs减少并非由于CNS向外周运输障碍。随后，研究人员评估了Aβ42处理下的细胞降解和EV合成能力。结果显示，Aβ42处理显著降低溶酶体活性（LysoTracker染色减弱）和EV合成（CD9标记减少），但细胞活力无显著变化，提示p-tau217? EV合成/分泌受损是外周血中该亚群减少的主要原因。在APP/PS1小鼠中，12月龄AD小鼠血浆p-tau217? EV比例较野生型显著降低，而游离p-tau217水平升高，与临床观察一致。
通过质谱分析AD和HC CSF来源的p-tau217? EVs，研究人员发现HSPA8在AD中表达显著上调，且其作为上游调控因子而非p-tau217的下游靶标。HSPA8敲低在Aβ42处理细胞中显著恢复p-tau217? EV分泌。机制研究表明，HSPA8调控SNARE复合体组分（SNAP23、SNAP29等）的表达和相互作用。Co-IP实验显示，AD条件下HSPA8与SNAP29的相互作用减弱，而Aβ与SNAP29的结合增强；HSPA8敲低逆转了这些变化。体内免疫荧光结果也证实5×FAD小鼠皮层和海马CA1、CA3区域Aβ–SNAP29共定位增加，HSPA8–SNAP29共定位减少。
在APP/PS1小鼠中，海马内注射sh-HSPA8可改善Y迷宫和水迷宫认知表现，并恢复血浆p-tau217? EV比例，同时减少Aβ–SNAP29共定位。此外，研究人员设计并合成了靶向HSPA8结合位点的SNAP29 25-mer肽（残基156–180）。该肽在体外直接结合HSPA8，并在Aβ42处理细胞中降低Aβ–SNAP29共定位、增加HSPA8–SNAP29共定位，同时恢复p-tau217? EV分泌。在8月龄APP/PS1小鼠中，25-mer肽注射改善了新物体识别和Y迷宫自发交替行为，并显著增加血浆p-tau217? EV比例，同时降低海马CA1神经元p-tau217/t-tau比值。
讨论部分指出，HSPA8在AD中异常升高，通过促进SNAP29与Aβ的相互作用，破坏SNARE复合体组装，从而损害p-tau217? EV的合成和释放，导致细胞内p-tau217积累。抑制HSPA8可恢复EV分泌，减轻tau负担，改善认知功能，提示HSPA8是AD治疗的有前景靶点。研究还发现p-tau217同时存在于EV表面和内部，但机制尚待进一步探索。局限性包括：HSPA8促进SNAP29-Aβ结合的具体分子机制不明确；使用了APP/PS1而非tau突变小鼠；肽的BBB穿透性和神经元靶向性需进一步优化。
结论：研究鉴定HSPA8为神经元分泌p-tau217? EVs的关键调控因子，其在AD神经元中异常升高，通过改变SNAP29–Aβ相互作用损害SNARE复合体形成，减少p-tau217? EV释放并恶化AD病理。治疗性靶向HSPA8可恢复EV分泌并改善认知，为AD干预提供了新途径。
