《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Rethinking osteocyte models in vitro: the need for mineralised extracellular matrix and network architecture
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骨细胞位于人体内最极端的细胞微环境之一：一个水合、分层结构的矿化细胞外基质（ECM）中，其中骨陷窝限制、骨小管连接、流体传输和力学与细胞功能密不可分。体外骨细胞模型已通过3D培养、生物打印、图案化、微流体、多细胞系统和受控加载取得了快速进展。然而，当评估标志物
骨细胞位于人体内最极端的细胞微环境之一：一个水合、分层结构的矿化细胞外基质（ECM）中，其中骨陷窝限制、骨小管连接、流体传输和力学与细胞功能密不可分。体外骨细胞模型已通过3D培养、生物打印、图案化、微流体、多细胞系统和受控加载取得了快速进展。然而，当评估标志物表达、树突形成或整体矿化沉积而未定义提供局部线索的基质和网络结构时，生理学解释往往仍然有限。在此，研究人员通过以基质为中心和网络结构视角综述了工程化骨细胞微环境模型。强调了仿生矿化、粘弹性与图案化水凝胶、动态微生理平台以及ECM-细胞表征方面的进展。研究人员提出，进展将取决于模块化的、跨相关且计算可用的模型，这些模型连接矿化ECM、骨细胞网络拓扑、传输和力学。此类模型可将领域从描述性骨细胞样培养推向可解释生态位，从而解释骨细胞行为。
1 引言
骨细胞建模进展迅速，但定义具有生理学信息模型的标准仍不完全明确。当前体外骨细胞系统包括3D打印水凝胶、人类细胞、受控图案化、微流体和骨芯片平台、生物反应器以及仿生矿化。然而，验证仍常强调骨细胞标志物表达和树突样形态，而定义天然生态位的基质和流体传输特征较少被纳入。骨细胞身份体外通常通过形态、分子和功能读数联合评估，包括树突形成、E11/podoplanin、DMP1、PHEX/MEPE、SOST/sclerostin和FGF23表达、connexin 43介导的通讯、RANKL/OPG调节及对机械刺激的反应。这些读数受周围基质强烈影响，因此最好结合矿化ECM结构解释。骨细胞嵌入分层结构的矿化基质中，其方向反映在骨细胞网络本身。Bock等人认为ECM应被视为一种材料，其功能源于多尺度组织、水组织、流体传输特性、力学和适应，而非主要生化组成。骨 exemplifies 此原则，其功能依赖矿化胶原原纤维、非胶原蛋白、水、骨小管传输、骨陷窝限制和细胞介导的重塑。骨细胞陷窝小管网络（LCN）嵌入高度有序的矿化基质，作为相互的细胞-基质-流体系统：其结构塑造流体流动和机械感觉，而骨细胞机械信号调节骨建模、重塑和网络适应。因此，体外模型中的矿化需超越存在与否的定义。Reznikov等人将ECM矿化视为受调节的材料过程，涉及钙磷稳态、无定形前体、胶原结构、矿化抑制剂和促进剂及空间梯度。在生物制造模型中，整体钙沉积或羟基磷灰石颗粒添加不能重现矿化骨ECM。为生理学可解释，不仅需报告矿化物是否存在，还需报告其成分、空间分布及与周围基质和细胞的关系。近期研究展示了进展与挑战：一些模型包含矿化但未捕获骨细胞网络结构；其他改善细胞图案化和网络功能但未纳入矿化ECM；动态系统使用流、加载和多细胞相互作用，但骨细胞经历的局部刺激受胶原或水凝胶基质影响。这些差异应作为设计选择：首先定义每个模型旨在重现的生态位特征，其次询问这些特征如何塑造骨细胞生物学的机制结论。本文通过以基质为中心和网络结构视角综述工程化骨细胞微环境模型，讨论关键挑战，考虑基质、网络和功能表征如何加强生理学解释，并强调近期实验和分析进展。
2 骨细胞生态位作为矿化的细胞-基质网络
骨细胞生态位最好被理解为一个耦合的材料和传输网络。其关键特征不仅是基质坚硬、矿化或3D，而是矿化物、胶原、骨陷窝、骨小管、周细胞基质和流体路径跨多个长度尺度组织。这些特征决定外部机械和生化线索在到达细胞前如何被重新分布。矿化含量影响力学和流体传输。矿化通常增加刚度，但过度时降低韧性。在超微结构尺度，变形跨胶原、矿化物和界面蛋白分配，因此组织水平应变不统一传递给原纤维或矿化晶体。在微尺度，骨陷窝、骨小管和孔隙在骨细胞周围产生局部应变梯度和流体流动相关刺激。矿化沉积也可改变渗透性和溶质交换；例如，骨小管下纳米通道体积与人皮质骨钙含量负相关。对工程模型，矿化补充可能不仅改变刚度，还改变水合、孔隙连接和传输路径。胶原组织提供另一层次控制。板层骨中胶原原纤维非随机矿化，表现出优先取向，在界面和骨细胞空间周围存在局部无序。这有助于裂纹偏转和能量耗散，也塑造骨细胞网络。骨细胞网络取向反映ECM取向，网络结构与骨材料质量相关。因此，树突取向不仅是细胞内在表型，也受周围基质结构影响。在isotropic凝胶中形成的树突可能反映骨细胞样形态，但不一定反映天然样基质引导。由于骨异常坚硬，骨细胞刺激强烈依赖通过LCN系统的放大。流体流动假说提出加载诱导流体运动在骨细胞上产生剪切应力。溶质运动依赖LCN孔隙结构和加载，骨机械反应与LCN结构密切相关，而非仅与应用应变幅度相关。骨细胞网络结构也可能贡献机械设定点的物质体现。因此，相同外部负载可根据网络几何产生不同局部刺激。对体外模型，实际意义是骨细胞行为最好结合传递刺激的基质结构解释。不需每个平台重现完整矿化LCN生态位，每个模型可由其捕获的特征定义，如矿化分布、传输特性、基质取向、网络连接和机械信号传输。这为匹配模型设计与所问生物学问题提供框架。
3 静态系统
静态3D系统产生了一些最有用的骨细胞样表型，因为它们允许长培养时间、基质沉积和受控生物材料设计。然而，其解释强烈依赖基质背景定义得多好。
3.1 非矿化胶原和水凝胶模型
胶原凝胶仍广泛使用，因为I型胶原是骨主要有机基质成分，支持细胞粘附、树突形态和矿化沉积。Bernhardt等人在胶原中开发原代人骨细胞网络，并扩展到与成骨细胞和破骨细胞共培养和三培养模型，显示谱系相关基因表达和细胞类型特异性酶活性。三培养模型对旁分泌信号特别有用，但其解释仍在非矿化基质背景下。Nasello等人显示原代人成骨细胞在胶原中分化依赖细胞密度：高密度培养发育更长突起，增加ALP，下调BSP2，并在21天表达DMP1。这突出细胞密度和3D限制作为成骨细胞-骨细胞转变的重要调节因子。明胶和藻酸盐基水凝胶提供基质力学额外控制。Bernero等人最近使用藻酸盐-胶原互穿网络，具有可比刚度但不同应力松弛时间。快松弛凝胶促进早期铺展和更长突起，而慢松弛凝胶有利于后期ALP、DMP1、羟基磷灰石信号和间隙连接连接。这分离了刚度与粘弹性，表明基质松弛可调节骨细胞形态发生和网络形成。
3.2 矿化水凝胶和生物打印平台
水凝胶平台通常通过诱导培养基或钙/磷酸盐补充引入矿化，允许在细胞负载可调基质中研究矿化沉积。Yang等人证明生物打印可对骨细胞样培养施加空间控制。IDG-SW3细胞打印在GelMA/HAMA水凝胶中有或无胶原I，然后在矿化诱导培养基培养。含胶原构建体显示更强骨细胞样行为，包括增加DMP1-GFP信号、钙沉积、E11/Podoplanin表达和树突形成。这些是具体成就，但矿化仍主要通过细胞相关钙沉积和整体水凝胶结果评估，留下纳米尺度或原纤维内矿化组织作为未来专门表征的重要目标。Da Costa Sousa等人用CaCl2、骨桥蛋白和K2HPO4矿化GelMA微凝胶，确认磷灰石样矿化物，维持骨细胞活力。然而，矿化微凝胶中树突长度和数量未显著改善，支持矿化单独不能建立成熟骨细胞网络。总之，这些研究表明矿化可纳入水凝胶基骨细胞模型，但需区分水凝胶内矿化沉积与骨细胞嵌入骨基质过程中发展的有序矿化胶原结构。
3.3 仿生和以基质为中心的矿化
此处仿生矿化用于基质中心意义：不仅是矿化物存在，而是刻意控制矿化前体化学或胶原相关矿化沉积和基质成熟。Thrivikranam等人将hMSC嵌入I型胶原水凝胶，使用稳定化超饱和钙磷培养基和乳源骨桥蛋白指导纳米磷灰石沉积到原纤维内和原纤维外胶原空间。基质通过EDX、TEM、FTIR、SEM、SAED和AFM表征。矿化增加单个水合胶原原纤维模量。系统促进hMSC成骨和前骨细胞特征，包括骨钙素、DMP1和E11/Podoplanin表达，树突样细胞突起延伸通过矿化基质，以及嵌入细胞周围骨陷窝样无胶原区域。尽管这是重要贡献，一个剩余限制是未报告SOST基因表达和sclerostin蛋白，表型主要定为成骨或前骨细胞。De Wildt等人最近通过将PILP矿化与折射率调谐结合扩展到体积生物制造。pAsp稳定的无定形磷酸钙前体实现光学可打印GelMA基生物树脂，产生高细胞密度hMSC封装的小梁样构建体。矿化树脂通过SEM/BSE、FTIR和EDX表征。构建体显示高活力、骨生成条件下增加钙沉积和早期骨细胞特征，包括树突样形态和podoplanin、骨钙素和DMP1表达。重要的是，作者指出直接原位矿化相表征仍具挑战性，强调需要专门和跨相关矿化表征。Iordachescu等人通过自组织而非预定义基质设计处理耦合骨细胞样网络形成与矿化基质成熟挑战。纤维蛋白凝胶在磷酸钙陶瓷锚间支持骨膜细胞沉积有序胶原-矿化基质。拉曼光谱和XRD确认羟基磷灰石与胶原相关，SHG显示胶原组织可比成熟小鼠股骨，纳米CT揭示骨细胞样细胞间骨小管样连接。此模型有价值，因为基质成熟、矿化和骨细胞样嵌入共同出现，尽管长期培养和较低结构控制限制其相比简化工程平台的实用性。
3.4 图案化和限制
图案化模型试图通过引导细胞间距、排列和连接控制网络结构。早期微珠引导灌注系统显示物理支架结构可引导3D骨细胞网络形成。Zhang等人比较非限制MLO-Y4单层与限制在GelMA或矿化GelMA下细胞，实现实时钙成像，显示连接骨细胞网络跨空间异质Ca2+反应，表明限制改变流诱导信号传播方式。Gehre等人使用光敏双光子消融在含hMSC的GelMA水凝胶中雕刻微米尺度通道。添加P2CK光敏剂降低消融阈值五倍，实现低能量图案化1 μm宽、30 μm深通道；7天后，细胞延伸突起进入通道并形成网格对齐3D网络。这是用户定义骨小管样引导的优雅但技术要求高的例子。Poudel等人使用飞秒激光辅助空化在微流体芯片内原生胶原中创建用户定义3D微通道网络。MLO-Y4细胞形成具有定义连接的‘Cellnets’，在流和离子霉素刺激下实时Ca2+信号传播，靶向网络损伤后信号重定向。尽管非矿化，这强烈链接3D网络结构到功能扰动。微孔水凝胶通过光聚合诱导相分离提供预定义激光通道的补充路线，支持快速3D铺展、树突形态发生、成骨读数、微流体集成和体积打印。支架尺度地形研究进一步表明几何和化学地形线索可支持成骨排列、矿化沉积和骨细胞相关标志物表达，同时强调需更好将这些结果与有序矿化ECM连接。
4 动态和微生理系统
动态骨细胞模型引入流体流动、机械加载、空间梯度、多细胞界面和时间依赖线索，静态培养不易捕获。然而，其解释依赖区分应用于平台的刺激与骨细胞在工程基质内经历的局部刺激。微流体系统对控制骨细胞通讯特别有用。Yvanoff和Willaert使用机器人细胞打印创建空间定义骨细胞-成骨细胞阵列，分析connexin 43介导通讯、钙波、AFM基机械刺激和流体流动反应。Merife等人将微流体刺激扩展到脉动单向流体流动刺激下胶原中自组装MLO-Y4网络。每日脉动流触发3D骨细胞网络Ca2+信号，维持数个骨细胞相关基因达21天，并允许估计刺激期间胶原变形、应力和速度场。这些提供有用动态平台，而矿化ECM结构整合仍是重要下一步。灌注和机械加载生物反应器暴露骨细胞样细胞于受控3D机械环境。Rindt等人开发具有独立流和循环压缩的生物反应器，使用IDG-SW3细胞在脱细胞骨、激光纹理化矿化胶原和β-TCP支架上。激光纹理化矿化胶原支持均匀再种群和动态分化；灌注增加DMP1、SOST和CX43，而压缩上调机械敏感基因包括FOS和PTGS2。这提供受控3D机械刺激强例子。人BMU-on-chip系统将动态建模扩展到协调重塑。Woo等人分化原代成人成骨细胞为胶原凝胶内骨细胞，然后引入成骨细胞和破骨细胞前体建模骨重塑周期阶段。与transwell培养比，芯片增加成骨细胞和骨细胞相关反应、重塑相关信号和破骨细胞相关活性。这为时空细胞-细胞信号提供有用平台，而矿化丰富ECM和血管成分是未来机会。动态平台也与疾病建模和药物筛选相关，因为骨疾病和骨折修复涉及细胞-基质特性耦合变化。对基质依赖问题，这些系统应不仅报告流、压缩或芯片几何，还应报告这些线索如何通过ECM传输。Bessot等人支持此原则：矿化补充成骨预培养促进更板层样胶原，改善骨细胞排列，产生更高局部弹性模量区域，尽管骨细胞密度或树突数量变化有限。这加强有用设计原则：可能时，基质组成应链接到网络组织和局部力学，而非分开评估。动态系统应视为互补平台。下一挑战是连接其优势与更好定义的矿化基质结构。
5 表征ECM-细胞耦合
体外骨细胞建模未来进展可能更少来自添加更复杂设备，而更多来自生物制造与矿化、基质、传输和网络结构的严格表征耦合。Bock等人主张多尺度、多模式和时间内分辨ECM分析，关注样本制备、水合、传输和结构坐标。因为矿化与网络结构和传输过程复杂链接，报告相关基质特征很重要，如矿化量、其空间分布，以及胶原组织、水合和渗透性连同机械性能。拉曼光谱可定义ECM化学、矿化-基质特征，当使用极化方法时，胶原组织方面，已应用于矿化骨样构建体。FTIR和XRD帮助确认矿物相、结晶度和矿化-基质比。SEM/EDX、qBEI和微CT映射矿化分布和体积。SAXS/WAXS可解析矿化颗粒厚度和取向，SAXS链接胶原排列到跨软-矿化界面的矿化取向。TEM和SAED定位原纤维内和原纤维外矿化，而FIB-SEM提供矿化与LCN关系的3D纳米尺度信息。SHG和CLSM对关联胶原组织与骨细胞网络排列特别有用，而纳米压痕和流变学连接结构到局部或整体力学。茜素红和von Kossa染色是有用筛选读数，但不显示矿物相、胶原关联或相对于细胞和网络空间的空间分布。因此，后续方法应选择测试相关机制，如矿化化学、矿化分布或胶原-矿化组织。Bessot等人提供有用例子，通过适应TIMA（通常用于地质矿化分析的工具）到生物工程骨。通过关联胶原-I和胶原-II免疫组化与BSE和TIMA-EDX图，他们链接基质身份到矿化组成，显示不同Ca/P比在胶原-I阳性矿化骨和胶原-II阳性矿化软骨。此类工作流将矿化评估从询问矿化物是否存在转移到询问什么矿化物存在、位于何处及如何与基质身份和组织相关。网络表征也应超越代表性图像。Yang等人量化生物打印IDG-SW3构建体中细胞体体积、树突数量和树突长度，连同CX43、E11、DMP1、矿化沉积和PTH反应。Bernero等人使用IMARIS量化粘弹性藻酸盐-胶原水凝胶中骨细胞面积和树突长度，然后关联形态到应力松弛、ALP、DMP1、羟基磷灰石和间隙连接形成。未来研究可通过映射这些指标对抗矿化密度、胶原组织、局部刚度和传输路径获得进一步见解。因为IMARIS和Image-Pro Plus昂贵，验证的开源分割工作流将日益重要，连同专门工具如TINA用于量化骨细胞LCN结构。功能表征仍必需。DMP1、E11、SOST、FGF23和CX43是有用标志物，但应尽可能配对PTH反应、RANKL/OPG调节、钙信号、流反应、机械敏感基因和对成骨细胞或破骨细胞效应。最强未来研究将不仅显示更复杂网络；他们将使用跨相关工作流在空间匹配数据集中配准活细胞成像、胶原组织、矿化化学、力学和传输。实践中，本节描述方法不需每研究全部应用；作为核心标准，骨细胞活力和表型应结合3D共聚焦成像和定量网络分析使用已建立通用软件（如Imaris），而LCN特定工具如TINA代表需要专门专业知识的更高级选项。当研究力学或传输时，易用的第一线方法包括整体流变学或压缩测试和荧光示踪扩散或FRAP，而纳米压痕和空间分辨传输映射代表高级方法。极化拉曼映射、微CT/qBEI和SHG形成进一步高级层，而SAXS/WAXS、TEM/SAED和FIB-SEM是专家、资源密集型方法，其整合到完全配准跨相关工作流对许多实验室仍属期许。
6 展望
体外重现骨细胞生态位固有困难，因为它跨多个长度尺度，从组织水平力学到纳米尺度矿化和流体传输，同时耦合基质结构、细胞网络和生化信号。当前骨细胞模型主要限制不仅是缺乏复杂性，而是这些特征间耦合不完全。以细胞为中心系统可产生骨细胞样标志物、树突和信号反应，而以基质为中心系统可重现矿化胶原、组织组织和局部力学方面。下一挑战是连接这些优势到矿化ECM、网络结构、传输和力学可一起解释的模型。此外，尽管重现生理学相关骨细胞微环境仍是广泛目标，生理学保真度不应视为通用或包罗万象的设计目标，因为必须重现的特征依赖生物学问题。基质既是指导性输入，也是细胞生成、动态重塑的输出；因此，在重现成熟生态位结构和重现其出现过程之间的选择也应依赖问题。可区分两个互补建模原则。工程重建将骨细胞置于预定义组成、力学、矿化或LCN样几何基质中，因此非常适合可重复机制比较和药物筛选。相反，自组织、涌现模型可利用天然生态位形成可转移原则：成骨细胞组织和沉积富胶原骨样基质，子集被嵌入并延伸树突突起，矿化在与发育中LCN紧密空间关联中进展。此序列可利用适当密度成骨细胞谱系细胞、允许细胞重塑基质和空间或机械边界线索，允许基质沉积、细胞嵌入、网络形成和矿化共同演化。当相互细胞-基质相互作用是核心时，自组织原则也可通过混合模型纳入工程重建，定义初始基质组成、微孔率和边界条件，同时允许细胞介导基质降解和沉积、网络形成和渐进矿化。模块化策略可能提供最清晰前进路线。增加复杂性不自动有益，因为一次添加几个变量可模糊因果解释。相反，明确定义模块，如矿化基质、图案化网络、机械刺激、多细胞信号或重塑样界面，可独立验证然后逐步组合。此方法将允许每个平台匹配所问生物学问题：微流体芯片对细胞-细胞信号最有用，生物反应器对受控机械刺激，自组织构建体对基质成熟。细胞来源是此设计问题部分。MLO-Y4对树突、间隙连接连接网络和活机械信号有用，但有限基质矿化和晚期内分泌能力。尽管在3D模型中较少代表，OCY454已在3D水凝胶/支架系统探索，并提供比MLO-Y4更成熟骨细胞信号，包括稳健DMP1-reporter和SOST/sclerostin相关反应，使其对研究矿化基质环境中骨细胞样信号有用。相反，IDG-SW3支持成骨细胞-骨细胞分化。原代人成骨细胞/骨细胞模型改善人类相关性但可扩展性较低。hMSC或骨膜细胞系统对工程基质沉积、矿化和早期骨细胞嵌入强，但成熟骨细胞功能需进一步验证。这些差异应视为设计选择而非限制本身。数学和计算模型可补充体外系统，通过链接可测量结构到预测功能。LCN中流体流动、信号传播和骨细胞网络增长模型已显示网络结构影响渗透性、机械敏感性和细胞嵌入动力学。多尺度模型链接加载、支架结构、组织形成和重塑。然而，这些方法体内仍难验证，尚未广泛用于生物制造骨细胞系统。因此，具有定义基质和网络扰动的受控体外平台可提供宝贵数据集用于精炼和验证计算模型。此策略要求报告参数既生物学有意义又计算可用，包括胶原组织、矿化相和分布、Ca/P比、刚度、粘弹性、渗透性、骨陷窝样限制、树突长度、分支和连接。相反，模拟可通过预测哪些基质结构、孔径、矿化梯度或流态最可能产生生理学相关骨细胞刺激帮助指导实验设计。相关工作在软组织-骨界面也显示模拟可揭示单独实验难推断的负载传递策略。这对疾病建模和药物筛选特别有价值，其中细胞行为、基质组织和力学变化耦合。总之，骨细胞建模进展将依赖超越表型模拟转向预测生态位工程。目标不是体外完全复制骨，而是重现对特定生物学问题最相关的生态位特征。为此选择性方法具机制有用，平台可能需定义旨在测试的基质和网络特征，当这些特征对问题核心时共工程骨细胞网络和矿化ECM，并通过空间匹配基质、力学和功能读数表征它们，可为计算模型提供信息。此转变将领域从描述性骨细胞样培养推向可解释生态位，从而解释骨细胞行为。
