具备NET形成能力的中性粒细胞亚群驱动蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤

《Frontiers in Neuroscience》：A NET-competent neutrophil subpopulation drives early brain injury after subarachnoid hemorrhage

　　

引言：蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）后的早期脑损伤（early brain injury, EBI）是决定神经功能预后的关键，但其细胞驱动因素仍不清楚。方法：为了系统地解析急性致病程序，研究人员对从SAH小鼠模型中分离出的CD45⁺免疫细胞进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），并结合加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）。结果：研究揭示了一个在24小时特异性富集的损伤模块，该模块富含炎症和髓系相关通路。将该模块映射到单细胞图谱上，发现中性粒细胞是主要的细胞介导者。高分辨率亚群聚类进一步定义了一个独特的中性粒细胞亚群N_04，它是24小时致病信号的主要携带者。N_04在转录水平上为中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap, NET）的形成做好了准备，关键效应因子包括Padi4、Mmp8和Lcn2，且空间映射将N_04定位于穿刺点附近的区域。转录调控分析确定Padi4、Nfe2和Cebpe为维持N_04效应身份的核心节点，而体内Padi4缺陷或NET降解显著减轻了神经功能缺损。拟时序和计算扰动分析表明，N_04代表一个终末效应状态，协调超炎症、脱颗粒和应激反应程序。细胞间通讯模型进一步将N_04定位为信号中枢，通过Cxcl、Ccl和APP途径介导与巨噬细胞的双向串扰。讨论：总而言之，这些发现将一个具备NET形成能力的中性粒细胞亚群定义为SAH后急性脑损伤的核心驱动因素，并提示依赖于Padi4的NETosis（NET形成过程）是一个潜在的治疗靶点。

蛛网膜下腔出血是一种具有高早期死亡率和长期残疾率的破坏性神经系统急症。尽管最初的出血会引起即时的机械和血管损伤，但随后的大部分神经功能恶化被认为源于早期脑损伤，即在发病后72小时内发生的复杂级联反应。神经炎症被广泛认为是此阶段驱动继发性损伤的核心机制之一。越来越多的证据表明，这一时期伴随着神经免疫微环境的快速重塑，涉及中枢神经系统（central nervous system, CNS）常驻免疫群和外周浸润的白细胞。然而，目前对于这些早期免疫反应在时间和空间上的组织方式，以及哪些细胞状态与组织破坏程序最直接相关，仍不完全清楚。这种不确定性可能解释了为何广谱抗炎策略在SAH后的临床获益有限。EBI并非由单一的炎症过程构成，而是由不同细胞类型、激活状态和时间窗口的异质性免疫反应共同塑造。传统的转录组学和组织学方法缺乏区分广泛激活的免疫区室与具有显著损伤潜力的离散致病细胞状态的分辨率。因此，确定哪些免疫细胞群和细胞状态主导SAH超急性期的急性致病反应至关重要。在浸润的白细胞中，中性粒细胞是塑造超急性期损伤的强有力候选者，但过去在SAH中常被视为相对同质化的短暂首发反应者，这种观点可能掩盖了具有独特效应程序和巨大病理影响的专业化中性粒细胞状态的存在。为了解析急性免疫反应的时间和空间解剖学逻辑，研究人员开展了一项结合纵向单细胞RNA测序与空间转录组学的研究，以绘制超急性期异质性免疫细胞状态图谱，识别与EBI相关的特定致病亚群，并评估靶向关键中性粒细胞效应程序是否能减轻急性神经功能缺损。该研究为SAH后的神经炎症提供了更精细的细胞和分子框架，指出了精准免疫调节的潜力，并发表在《Frontiers in Neuroscience》上。

本研究使用8-10周龄的成年雄性C57BL/6J野生型小鼠和Padi4缺陷型（Padi4^-/-）小鼠构建血管内穿刺SAH模型，样本队列来源包括假手术组及SAH后24小时和72小时组小鼠。研究人员从同侧大脑半球分离CD45⁺免疫细胞，利用Chromium平台进行单细胞RNA测序；同时制备脑组织冰冻切片进行空间转录组学测序。在生物信息学分析方面，采用加权基因共表达网络分析构建时间特异性基因模块，利用Monocle3进行拟时序轨迹推断，利用SCENIC进行基因调控网络分析，利用CellChat进行细胞间通讯网络推断，并使用scTenifoldKnk进行计算机模拟基因敲除扰动分析。此外，通过改良Garcia评分等行为学测试评估神经功能，并使用DNase I进行体内中性粒细胞胞外诱捕网降解实验。

SAH后24小时损伤模块定义了主导的早期致病程序
研究人员对三个时间点的CD45⁺免疫细胞进行了单细胞RNA测序和加权基因共表达网络分析。结果发现了三个特定时间模块：“棕色”模块（假手术组特有）、在24小时急性期特有的“绿松石”模块，以及72小时达到峰值的“黄色”模块。功能富集分析显示，24小时特有的“绿松石”模块的特征是急性炎症反应、白细胞趋化和髓系介导的免疫，表明24小时是致病程序激活的关键峰值。将这些模块分数投射到单细胞图谱上，发现中性粒细胞是24小时致病程序的主要细胞载体。空间转录组学验证了“绿松石”模块核心基因评分与中性粒细胞特征富集的空间点之间存在高拓扑重叠，尤其在血管周围和蛛网膜下腔。

N_04是富集24小时损伤模块最强的中性粒细胞亚群
为解析浸润中性粒细胞的内部异质性，研究人员进行了高分辨率重聚类，将其划分为六个不同的亚群（N_01至N_06）。时间分析表明N_04在24小时急性期占主导。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示，N_04的转录谱独特地富集了与白细胞激活、肌动蛋白细胞骨架组织和小GTPase介导的信号转导相关的通路，有效概括了24小时致病程序的功能核心。模块评分显示N_04在所有亚群中拥有最高的“绿松石”特征浓度。此外，N_04的标志物与24小时“绿松石”模块之间存在67个基因的稳健重叠，其中包括5个经典的NET相关基因，这定义了N_04为SAH后协调急性转录反应的主要中性粒细胞亚群。

N_04在SAH后表现出具备NET形成能力的效应程序
研究人员深入挖掘了24小时“绿松石”模块的核心基因，发现了与中性粒细胞胞外诱捕网形成相关的显著表达特征，关键介质包括Padi4、Mmp8和Lcn2。N_04在NETosis（NET形成过程）评分上表现出显著的特异性富集，基因集富集分析也证实了N_04内NETosis形成程序的显著激活。空间转录组学显示，N_04特征评分与NET形成评分存在显著重叠，主要集中在手术穿刺点附近和脑室边缘。SCENIC分析确定了Nfe2和Cebpe等转录因子为关键调控节点。体内实验证实，Padi4^-/-小鼠与野生型小鼠相比，神经功能缺损显著减轻；通过DNase I治疗进行药理学降解NETs同样改善了神经行为障碍。

SAH后出现具有增强炎症和效应特征的独特疾病相关中性粒细胞状态
差异基因表达分析表明，N_04的特征是效应相关基因（如Padi4、Scrg1、Ngp、Camp和Ltf）的稳健上调，而细胞粘附和基础信号相关基因显著下调。拟时序轨迹分析表明，N_04代表一个终末效应命运，关键驱动基因如Padi4、Camp、Ltf和Ngp呈持续显著上调。通过计算机模拟扰动分析敲除Padi4，预测会导致N_04转录组中四个核心功能模块（中性粒细胞激活、NETosis、应激反应和脱颗粒）的显著下游抑制，支持了Padi4在维持这种病理状态中的潜在调控作用。

细胞间通讯分析揭示N_04中性粒细胞是SAH后的主要信号接收者
利用CellChat推断细胞间通讯网络，网络中心性分析显示，在SAH后24小时，N_04主要作为主要信号接收者，在免疫亚群中表现出最高的传入相互作用强度，尤其是与巨噬细胞之间的通讯最为强烈。N_04显著富集了传入的CXCL信号。配体-受体水平分析显示，传入N_04的CXCL信号主要由Cxcl2-Cxcr2和Cxcl3-Cxcr2相互作用驱动。同时，N_04维持特定的传出信号，将Cxcl2-Cxcr2信号引导回其他中性粒细胞亚群，揭示了由巨噬细胞-中性粒细胞趋化串扰和中性粒细胞自放大趋化环路驱动的早期炎症模式。

讨论部分总结与结论翻译
讨论部分指出，广谱免疫调节疗法在改善SAH后临床结果方面的局限性，突显了对急性神经免疫生态系统理解的不足。传统上，浸润损伤中枢神经系统的中性粒细胞被视为同质化的通用效应群。然而，该研究揭示了它们深刻的转录异质性和特化的发育命运。N_04状态的出现挑战了SAH中中性粒细胞是旁观者的传统观点。N_04被独特地定位于穿刺点和脑室边缘，代表一种不同于早期招募或亚急性期调节状态的终末效应命运。这表明局部出血微环境可能主动将超炎症表型印迹在迁移的髓系细胞上。研究在机制上推进了对N_04病理性的分子机制表征，揭示了N_04通过由Nfe2、Cebpe和稳健的NF-κB/STAT信号控制的密集调控网络被预设为发生NETosis。计算机模拟和体内功能数据均表明，敲除Padi4或药理降解NETs能显著挽救急性神经行为缺陷，证明PADI4-NETosis轴是急性SAH后脑损伤的非冗余、主要驱动因素。此外，细胞间通讯模型将N_04定位为早期神经免疫微环境中的核心信号接收者，其与巨噬细胞和中性粒细胞亚群之间存在CXCL介导的双向串扰和自分泌/旁分泌趋化环路。
研究结论翻译如下：总之，通过整合单细胞和空间转录组学与计算模型，研究人员表征了SAH的急性免疫结构。研究强调了具备NET形成能力的N_04中性粒细胞亚群是早期脑损伤的时空受限的关键引发者。这些见解提供了一个高分辨率的细胞和分子框架，为下一代针对SAH的靶向、细胞状态特异性治疗铺平了道路。