基于热辐射计的太赫兹光谱技术表征光合作用淀粉

《Analyst》：Photosynthetic starch characterization using terahertz spectroscopy with a bolometerOpen Access

　　

近期研究表明，太赫兹光谱（terahertz spectroscopy）能够鉴别含有植物粉末样品的固体压片中淀粉的吸收峰，且受其他植物基质干扰极小。本研究将该分析方法应用于评估淀粉含量相对较低的植物叶片的光合能力。为监测通过光合作用产生的淀粉，研究人员使用配备热辐射计（bolometer）的傅里叶变换光谱仪（Fourier-transform spectrometer）在3.0–9.5 THz频率范围内对水稻叶片进行测量。研究人员在栽培2个月和3个月后收获淀粉过度积累突变体（α-葡聚糖水二激酶1，α-glucan water dikinase1）和野生型（粳稻品种Nipponbare）。在太赫兹测量中，所有叶片均在9.0 THz处表现出归属于淀粉的吸收峰，且峰强度与化学分析获得的淀粉含量一致。此外，二阶导数信号与淀粉含量之间发现相关性（R² = 0.86–0.87）。然而，研究人员利用9.0 THz峰顶与8.65–9.35 THz之间基线计算的峰高开发了更高精度的模型（R² = 0.91）。结果表明，仅三个频率即可代表全波段光谱，提示未来淀粉传感器的可行性。因此，太赫兹技术可作为评估未纯化植物叶片中淀粉积累和光合能力的有效分析方法。

**基于太赫兹光谱技术的植物叶片光合淀粉表征研究解读**

**一、研究背景与科学问题**

淀粉是植物体内最重要的生物大分子之一，由葡萄糖单元通过α(1→4)和α(1→6)糖苷键连接而成，颗粒尺寸为1–100 μm。其中α(1→4)糖苷键形成晶体结构，而α(1→6)糖苷键呈无定形态，使淀粉颗粒具有半结晶特性。植物在白天通过光合作用在绿色叶片中合成并积累淀粉，夜间将其降解为糖类以供代谢需求，因此监测淀粉的积累与降解可直接反映植物的光合能力。传统的淀粉定量方法——酶法虽然精度高，但需要繁琐的预处理步骤，包括纯化、糊化和酶反应等。为此，研究人员常使用光合仪测定植物叶片中的CO₂同化量作为替代指标，但CO₂作为光合作用的原料，其同化量并不总是与淀粉合成直接相关，因为从CO₂到淀粉的代谢途径十分复杂，二者之间存在明显的脱节。因此，直接监测植物叶片中的淀粉含量将能够更精确地评估光合能力。

太赫兹波（terahertz, THz）位于毫米波与中红外波之间，通常定义为0.1–30 THz频率范围（波长3 mm–10 μm）。太赫兹光谱能够观测由弱非共价键引起的分子间振动以及对分子长程有序结构敏感的集体振动模式。晶体分子呈现特征吸收峰，而非晶态则几乎没有或仅有微弱吸收峰。近期研究利用傅里叶变换光谱仪在3.0–13.5 THz范围内测量含有未纯化绿豆粉末的固体压片，成功在9.0–13.5 THz区域观察到归属于淀粉的吸收峰，并利用9.0 THz处的峰强度实现了淀粉定量，表明太赫兹光谱能够从植物样品中选择性检测淀粉信号，且几乎不受其他植物基质干扰。然而，将这一方法应用于实际植物叶片面临两大挑战：其一，光合组织中叶绿素在9.0 THz附近存在潜在吸收峰，可能与淀粉峰重叠；其二，水的吸收系数极高，在1 THz时为200 cm^–1，10 THz时高达1000 cm^–1，远高于淀粉在1 THz时的20–30 cm^–1，高频率区域水分的影响尚属未知。此外，与之前研究的绿豆样品（最高淀粉含量≥50%）相比，水稻叶片中淀粉含量较低，且叶片本身是非均质样品，厚度不一，这些因素均增加了检测难度。

**二、研究目的与实验设计**

本研究旨在利用配备高灵敏度热辐射计的傅里叶变换太赫兹光谱仪，以透射模式对植物叶片中的淀粉进行定性和定量分析。研究人员选择水稻作为目标样品，原因在于水稻是亚洲国家的重要作物，且谷物中A型淀粉的THz峰强度高于块茎中的B型淀粉，这与A型淀粉更高的结晶度和更小的颗粒尺寸有关。研究首先获取标准化学物质（淀粉和叶绿素）的THz光谱以确认光谱特征，随后在干燥过程中测量水稻叶片以考察含水量对THz光谱的影响，最后在适宜条件下对叶片进行淀粉鉴定和定量。研究采用α-葡聚糖水二激酶1（α-glucan water dikinase1）敲除突变体（即leaf excess 1突变体）及其背景品种Nipponbare作为野生型，在东京大学温室内（北纬35°43′，东经139°45′）培育，分别于栽培2个月和3个月后收获完全展开叶片。区别于以往研究使用的氘化三甘氨酸硫酸酯（DTGS）探测器，本研究采用热辐射计作为探测器以检测水稻叶片中的微弱淀粉信号。热辐射计虽需冷却且因内滤光片吸收最多测量至10 THz，但其灵敏度远高于DTGS探测器。

**三、主要关键技术方法**

本研究采用的主要技术方法包括：傅里叶变换太赫兹光谱法（配备高灵敏度热辐射计探测器，测量范围3.0–9.5 THz，分辨率0.03 THz，N₂吹扫以避免水蒸气吸收干扰）；X射线衍射（XRD）分析（用于表征淀粉和叶绿素的晶体结构）；酶法淀粉定量分析（使用葡糖淀粉酶和E-kit d-葡萄糖试剂盒）；Savitzky–Golay二阶导数光谱分析和偏最小二乘回归（PLSR）建模。植物样品来自东京大学温室培养的水稻叶片（突变体和野生型各15片，共30片），在50 °C干燥后用于THz测量。

**四、研究结果**

**标准化学物质光谱特征。** XRD分析显示，水稻淀粉呈单斜晶体结构，在2θ = 15°、17°、18°和23°处出现衍射峰；而叶绿素呈无定形状态，无衍射峰。THz测量中，水稻淀粉在9.0 THz处呈现归属于葡萄糖单体骨架变形的吸收峰，而叶绿素在9.0 THz附近虽检测到微弱信号，但其强度与基线波动相当，表明非晶态叶绿素对9.0 THz处淀粉吸收峰的影响极小，这与预期相反。这一发现为后续叶片测量排除了主要干扰因素。

**叶片含水量对THz光谱的影响。** 研究人员在50 °C下对新鲜叶片进行0–360 min的干燥处理，实时监测THz光谱变化。新鲜叶片因水分强吸收导致4.0 THz以上吸光度饱和，但随干燥进行光谱逐渐下降。干燥15 min后（含水量24.9%），光谱不再饱和，9.0 THz处出现吸收峰。干燥30 min后吸光度趋于恒定，表明至少需要30 min干燥才能获得稳定的THz光谱。值得注意的是，由于N₂吹扫导致水分在测量过程中持续蒸发，即使未经干燥的新鲜叶片含水量也仅为48.5%（测量前为61.8%）。与以往利用时域THz系统在低频区监测叶片水分的研究相比，本研究采用3.0–9.5 THz的高频范围更适用于识别淀粉的特征吸收峰，因为淀粉在5.0 THz以下不表现出明显吸收峰。

**水稻叶片生长数据。** 30片叶片的淀粉含量范围为干重的0.6%–13.2%，突变体在两个生长阶段的淀粉含量均高于野生型。压片厚度为83–126.8 μm，同一生长阶段突变体与野生型之间差异不大。从2个月到3个月，淀粉含量和叶片厚度均有所增加，这可能归因于当前生长条件下营养生长期的推进。

**水稻叶片THz光谱。** 所有叶片样品（平均含水量4.7%）在3.0–9.5 THz范围内呈现与化学淀粉相似的光谱特征，尽管叶片中存在大量植物基质。经叶片厚度归一化后，9.0 THz处的峰强顺序为：突变体3个月 > 突变体2个月 > 野生型3个月 > 野生型2个月，该顺序与化学分析获得的淀粉含量一致，成功区分了水稻生长过程中淀粉积累的差异。突变体3个月样品的最大淀粉含量仅为13.2%，比之前豆类样品低约4倍，但配备热辐射计的THz光谱仍显示出足够的检测灵敏度。植物组织中的叶绿素以色素-蛋白复合物形式存在，可能在低频区（1.5和2.0 THz）有特征吸收，但本研究中叶片未检测到这些物质的明显信号，不过在其他植物物种测量中仍需考虑叶绿素-蛋白复合物的影响。

**淀粉含量评估模型。** 研究首先利用二阶导数峰强度和全波段光谱建立定量模型。线性回归分析显示峰强度与淀粉含量之间的R² = 0.87，均方根误差（RMSE）为2.1%；PLSR分析利用全波段光谱获得相似精度（R² = 0.86，RMSE = 2.2%）。PLSR模型的回归系数仅在9.0 THz处出现明显正值，表明9.0 THz以下频率对淀粉信息的贡献甚微。叶片厚度归一化处理显著提升了两种分析的模型精度，这符合朗伯-比尔定律（A = εcl），干燥叶片主要由空气和固体植物基质组成，前者不直接参与吸光，因此透射模式下厚度补偿是有效的。

在此基础上，研究人员进一步开发了仅利用三个频率点的峰高模型：以9.0 THz为峰顶，以8.65和9.35 THz为基线两点进行线性拟合，计算峰顶与基线之间的差值作为峰高。由于所有叶片的光谱基线斜率均向高频方向上升，该基线校正十分必要。经叶片厚度归一化后，该模型获得最高精度（R² = 0.91，RMSE = 1.8%），优于二阶导数法和PLSR模型。二阶导数法需从21个频率点计算，噪声和伪影可能同时影响光谱和淀粉信号，导致模型精度下降；而仅用三个频率点的峰高计算能够更直接地获取淀粉信息。与近红外光谱法相比，近红外区O–H和C–H等官能团的振动吸收峰与糖类、纤维素等结构相似的分子重叠，导致淀粉测量精度不稳定且严重依赖全波段多变量分析，而THz光谱对植物样品中非晶态组分不敏感，在淀粉测量中具有独特优势。

**五、结论与意义**

本研究成功利用配备高灵敏度热辐射计的傅里叶变换太赫兹光谱仪在透射模式下对水稻叶片中的淀粉进行了表征和定量分析。相较于以往仅能检测粉末状植物样品中的淀粉，本研究将该方法扩展至非均质、厚度不一且淀粉含量相对较低的植物叶片，证明THz测量中并非必须制备压片。更重要的是，基于三个频率点的峰高模型表明，仅需少数几个频率即可实现淀粉监测，提示未来开发专用淀粉传感器的可行性。由于酶法需要复杂的预处理步骤，太赫兹光谱技术将成为植物科学和农业领域评估光合能力的重要分析工具。进一步对不同植物叶片的THz测量将有助于验证该方法作为综合评价光合能力的通用分析技术的适用性。