海南养殖暹罗鳄（Crocodylus siamensis）中多重耐药雷氏普罗威登斯菌（Multidrug-Resistant Providencia rettgeri）：一种新发病原体的研究

《Transboundary and Emerging Diseases》：Multidrug-Resistant Providencia rettgeri: An Emerging Pathogen in Farmed Siamese Crocodiles (Crocodylus siamensis) in Hainan, China

　　

中国海南省暹罗鳄（Crocodylus siamensis）养殖业规模显著扩大，尤其集中于海南地区，但正面临传染病威胁日益增加的挑战。普罗威登斯菌属（Providencia spp.），特别是雷氏普罗威登斯菌（P. rettgeri），在爬行动物疾病暴发中报道渐增，但其在养殖暹罗鳄中的流行病学与致病特征仍知之甚少。研究人员对来自海南省三个农场的18只死亡幼龄暹罗鳄进行剖检与组织病理学观察，发现提示败血症的多器官严重病变。通过16S rDNA与fusA系统发育分析，从样本中分离获得65株普罗威登斯菌，归为四个种级簇：P. rettgeri、P. stuartii、P. hangzhouensis与P. alcalifaciens。多数分离株运动性强而生物膜形成能力弱。关键的是，全部65株均为多重耐药（multidrug-resistant, MDR），携带多样抗菌药物耐药基因（antimicrobial resistance genes, ARGs），74%含1类整合子（class 1 integrons）。毒力相关基因（virulence-associated genes, VGs）广泛分布。斑马鱼攻毒试验确认5株代表性分离株均具致病性，其中P. rettgeri菌株PL-425与PL-688毒力最高（24–30 h内100%死亡）。对PL-425进行全基因组测序，鉴定出与运动性、荚膜、黏附及毒素相关的多个毒力位点。上述发现确定多重耐药P. rettgeri为养殖暹罗鳄中优势且高毒力病原体，凸显其作为产业重大威胁的新发地位，并迫切呼吁整合监测与抗菌药物管理（antimicrobial stewardship）。

研究背景方面，鳄类养殖作为重要水产经济板块，集约化加剧了传染病暴发风险。海南省是中国南方暹罗鳄圈养养殖重点区域，此前雷氏普罗威登斯菌（P. rettgeri）已在咸水鳄幼体脑膜炎、美洲短吻鳄败血症及蛇类菌血症中被报道，但在热带养殖暹罗鳄中的表型多样性、毒力异质性、耐药谱与基因组特征有限。为明确该菌在暹罗鳄养殖系统中的病原学地位，研究人员于2022年10月至2024年3月从海南东方市四场、澄迈县一场、白沙黎族自治县一场收集18只死亡幼鳄，开展病理、微生物分离、系统发育鉴定、表型与耐药分析、斑马鱼模型攻毒及优势高毒力株PL-425全基因组解析。论文发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。

主要关键技术方法包括：对海南三地区养殖场死亡幼鳄标准化采集心血、肝、脾、肾、肺、脑、眼、肠、胃及胸腹腔积液等组织进行细菌分离培养；以16S rDNA联合fusA基因PCR扩增与邻接法系统发育树完成种级归类；采用结晶紫法测生物膜、半固体琼脂扩散法评运动性；以常规PCR筛查10种ARGs与intI1、纸片扩散法与微量肉汤稀释法测22种抗菌药敏感性定义MDR；PCR检测9种VGs；选5株代表株以约1×10⁵ CFU/尾剂量腹腔注射斑马鱼（每组30尾）观察72 h死亡率并做组织病理回收验证；对高毒力P. rettgeri PL-425行de novo全基因组测序（SPAdes组装）、PROKKA/Glimmer3注释、VFDB毒力基因预测与Circos可视化。

研究结果部分，3.1节尸检与组织病理显示死鳄有鼻腔眼睑黏液、腹侧瘀斑、胸腹腔积液、胃扩张与直肠梗阻；镜下肺 alveolus/faveolus 壁炎性增厚、肝脂肪变、肾小管上皮脱落、脾坏死、心稀排肌纤维、脑神经元萎缩、肠绒毛坏死脱落，符合系统性败血症而非局部定植。3.2节从18鳄多器官获65株普罗威登斯菌，16S+rDNA+fusA树归为P. rettgeri 31株（47.7%）、P. stuartii 18株（27.7%）、P. hangzhouensis 14株（21.5%）、P. alcalifaciens 2株（3.1%），P. rettgeri为优势种。3.3节表型上60.0%弱生物膜、70.8%强运动性，提示以运动驱动播散为主。3.4节ARGs中arnA、tetA、cpxA率100%，rpsL 98%、qnrD 95%，bla_TEM 77%，intI1阳性74%；药敏显示全部65株达MDR标准，多黏菌素B耐药100%（种内固有），左氧氟沙星、三类四环素各91%，亚胺培南与头孢吡肟仍全敏于P. rettgeri。3.5节VGs中ompA全员携带，fepC 57%、motA 51%、acrA 51%，papC仅9%；斑马鱼攻毒两株P. rettgeri（PL-425、PL-688）24–30 h致死100%，高于P. stuartii（42 h）、P. alcalifaciens（54 h）与P. hangzhouensis（72 h残活6.7%），PL-425致斑马鱼肝坏死空泡、脑水肿坏死、肠上皮坏死，镜像幼鳄多器官伤。3.6节PL-425基因组4,598,886 bp、GC 40.23%、4282 ORFs，VFDB富集鞭毛基因61、荚膜相关54、MR/P菌毛与IV型菌毛各18、α-溶血素/细胞溶素5、rtxA 4，从基因组层面解释高毒力。

讨论部分指出，既往鳄类普罗威登斯菌病多为个案，本研究以多组学串联证实养殖暹罗鳄体内该菌具分类多样、表型异质与普遍MDR；无脑膜脑炎组织学证据而呈败血症，P. rettgeri为优势致病种与既往咸水鳄、短吻鳄报告一致。弱生物膜+强运动性反映其偏迁移播散而非表面定植的毒力策略。耐药谱中四环素类高耐药与农场常规使用土霉素/多西环素/四环素吻合，tetA全员携带支持选择压假设（因用药记录不完整仅作谨慎关联）；多黏菌素B为种内固有耐药，替加环素结果受培养基新鲜度影响须慎读；1类整合子高流行提示可移动遗传元件促AMR水平转移，养殖场或成AMR reservoir。斑马鱼模型交叉验证PL-425真病原性。结论翻译为：多重耐药雷氏普罗威登斯菌是海南养殖暹罗鳄中占优势且高毒力的病原体，其作为新发威胁凸显对产业的风险，迫切需整合病原监测与抗菌药物管理（antimicrobial stewardship）纳入同一健康（One Health）框架。